日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？
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| アプリケーションノート 2018＜01＞ 製 品 名： FastGene™ RNA Premium Kit（FG-81050, FG-81250） メーカー名 ： 日本ジェネティクス株式会社 製 品 名： Transcriptor Universal cDNA Master（05893151001） メーカー名 ： ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社 製 品 名： KAPA SYBR Fast qPCR Kit（KK4610, KK4611） メーカー名 ： KAPA BIOSYSTEMS 社 |
下記データは、学校法人トヨタ学園 豊田工業大学 先端工学専攻 高分子ナノ複合材料研究室
古谷 充 様の御厚意により掲載させていただきました。
本実験の目的
1）hMSC（ヒト間葉系幹細胞）の軟骨分化と骨分化誘導を実施する予定があるため、事前準備として、hMSC-BM（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）を用いて次の10 種類の遺伝子をターゲットにしたプライマーチェックを行った。
遺伝子：ACTB、GAPDH、RUNX2（2 種）、ALPL、Collagen Type I 、SP7/Osterix、BGLAP（2 種）、SOX9、Aggrecan、Collagen Type II（11種）
2）逆転写反応の推奨インプットRNA最大値である2.5 μgでもqPCRによる解析に使用できるか検証した（Sample A）。
実験条件
■ RNA抽出 FastGene™ RNA Premium Kit
• 初発サンプル：hMSC-BM（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）1.8×106 cell
• 溶解バッファー RL量：600 μL
• サンプル前処理：細胞に溶出バッファーRL（600 μL）を添加して、 ホモジナイズせずにボルテックスのみで溶解させた。
• 溶出バッファー RE：50 μL
• 収量・純度測定：NanoDrop One（Thermo Fisher Scientific社）
■ 逆転写 Transcriptor Universal cDNA Master
• インプットRNA量：total RNA 1.0 μg（Sample B） または 2.5 μg（Sample A）
• プライマーの種類：ランダムヘキサマープライマー
• 反応組成：RNA
• 反応プログラム： アニーリング 25℃・5 min
↓
酵素反応 55℃・10 min
↓
変性失活 85℃・5 min
■ 発現定量解析 KAPA SYBR Fast qPCR Kit
• インプットcDNA量：DEPC処理水で10倍希釈した逆転写反応液 2 μL（1反応 10 μLあたり）
• リアルタイム装置：LightCycler® 96
• 反応組成： cDNA
• 反応プログラム： 初期変性 95℃・3 min
↓
変性 95℃・10 sec
アニーリング 60℃・20 sec
伸長反応 72℃・1 sec
↓
メルティング
↓
クーリング 40℃・10 sec
結果
1．RNA抽出
| 溶出バッファー量（μL） | 濃度（ng/μL） | A260/A280 | A260/A230 | A260 | A280 |
| 50 | 474.82 | 2.07 | 2.23 | 11.87 | 5.74 |
2．発現定量解析
Sample A（RNA 2.5 μg）
以下のとおり、全てのプライマーでそれぞれのターゲットを検出できた
● 増幅曲線
● Cq値とポジティブ／ネガティブ判定
Sample B（RNA 1.0 μg）
以下のとおり、ほとんどのプライマーでそれぞれのターゲットを検出できた
● 増幅曲線
● Cq値とポジティブ／ネガティブ判定
総評
• LightCycler® 96 system（高性能、簡易操作）
・メルトカーブに時間をかけないため、実験時間が短縮できて良い
・タッチパネルでの操作が簡単なため、初心者でもつかいやすい
・ソフトウエアもexcel との互換があるなど、非常に使いやすい
• FastGene™ RNA Premium Kit（安価、高品質）
・gDNA 除去をオンカラムでなく一度溶出させてから行うのは正直手間だと感じた
しかし、丁寧に行うため手慣れていなくてもしっかりとgDNA を除去できる安心感がある
・カラムが複数種類あるがプロトコールで色分けされており分かり易かった
・従来品よりも反応時間が大幅に減少して数をこなしやすくなった
・Q社のRNA精製キットと同等以上の品質で値段が安く満足
• Transcriptor Universal cDNA Master（簡便、高性能）
・プレミックスの試薬で2 種類の試薬とRNA を混合するだけで簡便に、しかも高品質にcDNA を合成することができ大変満足
当研究室はPCR 初心者ばかりのため、簡単な操作で済むのは大変ありがたい
• KAPA SYBR Fast qPCR Kit（安価、高感度）
・T社 qRT-PCR キット（細胞用）よりもきれいに検量線を引くことができた
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