【お客様事例】無菌性腹膜炎モデルマウスの腹腔細胞から抽出した RNAを用いた逆転写酵素反応の比較検討

日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは?

  • 当社製品を実際にご使用頂いた、正真正銘、日本国内の研究者様による評価データ
  • 製品をご検討中の方はもちろん、すでにお使いのお客様におかれましても、類似の研究をされている他の研究者の方の事例集としてご活用頂けます

アプリケーション検索専用ページはこちら


アプリケーションノート 2018<07>
製品名:FastGene™ Scriptase Ⅱ(NE-LS53, NE-LS63)
メーカー名:日本ジェネティクス株式会社

下記のデータは、東京大学のお客様のご厚意により掲載させていただきました。

はじめに

以前から、従来のキット(T 社)を使用して逆転写酵素反応を行ってきましたが、コストダウンと逆転写反応の正確性を高めるため、当製品の使用を検討致しました。
無菌性腹膜炎モデルマウスの腹膜細胞から抽出したRNAを用いて、従来のキット(T 社)と当製品で逆転写反応を行いました。
得られたcDNAにてqPCRを行い、Ct 値を確認することでキットの性能を比較しました。

検討方法

◆マウス実験ワークフロー
同様の条件で実験を行う
計2匹で 検討

RNA抽出 
TRIzol® を使用してRNA 抽出を行う。
DNase 処理:なし
RNA溶出バッファー量:100μL DEPC水
RNA測定:Thermo Fisher Scientific Nanodrop2000 
                
逆転写酵素反応(FastGene™ ScriptaseⅡ)
1) Oligo dT primer 1μLとテンプレートの total RNA 100ngを混合する
2) dNTP を2μL 加える
3) 計12.5μL となるように、DW(蒸留水、滅菌水)を加える
4) 65℃で5分インキュベート後、直ちに氷上にて冷却を行う
5) コンポーネントを添加する
  5x FastGeneTM Scriptase II buffer  4 μL
  0.1 M DTT              2 μL
  RNase Inhibitor                           0.5 μL
6) 42℃で2分間インキュベート
7) 氷上でRNA 懸濁液に、1μLFastGeneTM Scriptase IIを添加する
8) 42℃で50分インキュベートする
9) 70℃で15分インキュベートし酵素を完全に不活化させる


◆qPCR(KAPA SYBR Fast qPCR Kit)
●反応組成

Component               Volume           最終濃度     
KAPA SYBR Fast qPCR Master Mix(x2)     5 μL           1x 
Forward Primer 10μM                                              0.2 μL                    200nM
Reverse Primer 10μM                                             0.2 μL                  200nM
テンプレートDNA             必要に応じて      <20ng       
SDW                  総量が10μL になるように加える N/A   

●サイクルプログラム

Enzyme Activation  95℃  5分
 ↓
Denaturation      95℃    10秒
↓                                                                40サイクル
Annealing/Extension 60℃  30秒

結果

◆インプットRNAの収量・純度測定結果(TRIzolによる抽出)
<mouse No.1>

  RNA量(ng/μL) 純度(A260/A280)
刺激なし 11.2 1.89
刺激A 30.9 1.84
刺激B 7.8 1.85

<mouse No.2>

  RNA量(ng/μL) 純度(A260/A280)
刺激なし 57.1 1.66
刺激A 9.8 1.91
刺激B 19.1 1.71

◆qPCRによる比較
<mGapdh>


<Gene A>

お客様のコメント
従来のキットとFastGene ScriptaseⅡ を使用して実験を行いましたが、リアルタイムPCRの結果は、ほぼ同等の結果を示していると考えました。操作の手間についても、ほぼ同等でした。
価格は、FastGeneシリーズの方が安い傾向にあるので、その点はメリットだと思います。

質問してみる!

「?」と思ったらすぐ解決。
どんな小さなことでもお気軽に。
ご意見・ご感想もお待ちしています。

WEB会員

記事の更新情報を受け取りたい方はコチラ

WEB会員 登録フォームへ

GeneF@N とは?