研究で使用できる「クリニカルシーケンス」技術特集

クリニカルシーケンス関連新製品が続々登場

クリニカルシーケンスは、次世代シーケンサー(NGS)を用いて、患者個々の疾患関連遺伝子情報を解析する医療検査方法です。
クリニカルシーケンスとしてNGSを医療現場で使用するためには、正確かつ効率的にゲノムライブラリーを作製する必要があります。
本記事では、クリニカルシーケンスに関連する技術が採用された製品をご紹介します。

こちらのページでは、クリニカルシーケンス対象製品のほか「ライブラリー作製技術ポイント」等もご紹介しています。

NEW! KAPA EvoPlus Kit

アップグレードされた断片化酵素ミックスにより、さまざまな課題を解決します。

特長
  • アーティファクト(人工的な変異)の発生を低減
  • EDTAなどインヒビターの影響による断片化サイズのばらつきを改善
  • フラグメンテーションとAテーリングを統合した簡便なステップ
  • 操作時間を短縮(おおよそ2時間)
  • サンプルインプットレンジは10 ng ~ 500 ng(PCRフリーライブラリーは 75 ng以上から可能)*
  • プレートフォーマットタイプを新しく追加、完全に自動化可能なワークフローをご提供します。

*全ゲノムシーケンス、高品質gDNA、ダブルサイズセレクションをしていない、フルレングスアダプターを使用する、などの条件を満たす必要があります。

ストランドスプリットアーティファクトリード(SSARs)の抑制

KAPA EvoPlus Kit、KAPA HyperPrep Kit、NEBNext® U ltra™ I I F S、QIAseq F Xで500 ngのヒトゲノムからライブラリーを調製し(ダブルサイズセレクションを実行)、SSARs(キメラリードの1種であり、部分的に連続しないゲノム配列で構成されるリード)の割合を調べたところ、NEBNext® Ultra™ II FS、QIAseq FXキットではSSARsが存在する割合が高くなっているのに対して、KAPA EvoPlusライブラリーに存在するSSARsの割合は、機械的に断片化されたKAPA HyperPrepライブラリーと同等であり、ゼロに近いことが確認されました(0.002%)。

キメラの抑制

KAPA EvoPlus Kit、KAPA HyperPrep Kit、NEBNext Ultra™ II FS、QIAseq FXで500 ngのヒトゲノムからライブラリーを調製し(ダブルサイズセレクションを実行)、キメラリードの割合を調べたところ、KAPA EvoPlusライブラリーに存在するキメラの割合はKAPA HyperPrepライブラリーと同等のレベルで低いことが示されました。

さまざまな投入量で再現性のある酵素的断片化が可能

ヒトゲノムDNA(10 ng、100 ng、500 ng)を37℃で断片化したところ、いずれの条件においてもモードインサートサイズが約300 bpのライブラリーが調製されることが示されました。この検証実験ではフルレングスアダプター(KAPA UDIアダプター)を用いたKAPA EvoPlusワークフローを実施し(サイズセレクションなし)、2サイクルの増幅を行ったものをLabChip GX Touch HTとHT DNA HiSens Reagent Kit(PerkinElmer)で泳動しました。

ゲノムDNA溶液のバッファーの種類に関わらず再現性のある酵素的断片化が可能

10 mM Tris-HClまたは10 mM Tris-HCl、1 mM EDTAに溶解したヒトゲノムDNA(500 ng)を37℃で断片化したところ、どちらの条件においてもモードインサートサイズが約300 bpのライブラリーが調製されることが示されました。この検証実験ではフルレングスアダプター(KAPA UDIアダプター)を用いたKAPA EvoPlusワークフローを実施し(サイズセレクションなし)、2サイクルの増幅を行ったものをLabChip GX Touch HTとHT DNA HiSens Reagent Kit(PerkinElmer)で泳動しました。

断片化とAテーリングを統合した「Frag Tail Step」を採用

KAPA EvoPlusキットは、ゲノムDNA断片化からAテーリング までを1つのステップに統合し、ワークフローを大幅に簡略化しました。(Frag Tail Step)
また、試薬はレディミックスで供給されますのでライブラリー調製の準備はよりシンプルになります。
しかも、Frag Tail Stepからアダプターライゲーションの間にクリーンナップがありませんので、磁気ビーズでの精製が省略できます。
プレートフォーマット製品を選択いただくと、各ウェルに試薬が分注された状態で供給されますので、ライブラリー調製を自動で行っていらっしゃる方にも適したキットです。

チューブフォーマット

Cat.No. 製品名 単位 価格
(税抜き)
09420037001 KAPA EvoPlus Kit※1 24反応 ¥118,000
09420045001 KAPA EvoPlus Kit (PCRフリー) 24反応 ¥112,000
09420053001 KAPA EvoPlus Kit※1 96反応 ¥398,000
09420304001 KAPA EvoPlus Kit (PCRフリー) 96反応 ¥380,000
09420339001 KAPA EvoPlus Kit※2 384反応 ¥1,528,000
09420371001 KAPA EvoPlus Kit (PCRフリー) 384反応 ¥1,468,000
09420410001 KAPA Library Amp Primer Mix 384反応 ¥36,000

※1 KAPA Library Amp Primer Mix(Cat.No. KK2623) 無償添付
※2 KAPA Library Amp Primer Mix(Cat.No. 09420410001) 無償添付
※価格は2022年4月現在のものです。

プレートフォーマット

Cat.No. 製品名 単位 価格
(税抜き)
09420428001 KAPA EvoPlus Kit( プレートフォーマット)※3 96反応 ¥458,000
09420436001 KAPA EvoPlus Kit (プレートフォーマット/PCRフリー) 96反応 ¥437,000
09420479001 KAPA Library Amp Primer Mix (プレートフォーマット) 96反応 ¥12,000

※3 KAPA Library Amp Primer Mix(Cat.No. 09420479001) 無償添付
※価格は2022年4月現在のものです。

NEW! KAPA Universal UMI Adapter

Roche 固有の分子バーコード(Unique Molecular Indexes)を含むイルミナプラットフォーム用アダプター

本製品とKAPA ユニークデュアルインデックス(UDI)プライマーミックスを共に使⽤することで、分⼦バーコード付きのライブラリーを調製する事ができます。
各サンプルに付加した分⼦バーコードを解析することで、異なるリードを適切に判別することが可能となり、低頻度のバリアント検出の精度をさらに⾼めることができます。

低頻度変異の解析に必要な低エラー率を実現

独自の二本鎖バーコーディングを採用

⼀本鎖からなる分⼦バーコードと⽐較して、⾮常に低いエラー率を実現することができます。また、本製品による分子バーコード配列はインサート配列のすぐ隣に導⼊されるので、PCRによるキメラの発⽣頻度が低く、マッピングされないリードの割合を最小限にします。このため、効率の良いシーケンスを実現します。

慎重に設計された16種の配列既知の分子タグ

本製品は、ランダム配列の分子バーコードではなく慎重に選択した16種の既知配列の分⼦バーコードを使⽤しています。このため、バーコード上に⽣じたエラーは解析の際に除外できます。また、フラグメントの両側に付加する⽅式を採⽤しているため、16×16=256種類の分子が識別できます。解析時には、それぞれのフラグメントのスタート位置とエンド位置も考慮してユニーク分⼦を判別しますので、⼗分な感度での解析が可能です。

データ解析時にin silicoでオリジナルの⼆本鎖の配列を作成(再現)します。
(Integrated digital error suppression for ultrasensitive detection of circulating tumor DNA Nat Biotechnol. 2016 34:547-555.より改変)

Cat.No. 製品名 単位 価格
(税抜き)
09329862001 KAPA Universal UMI Adapter, 960 µL 96反応 ¥72,000
09134336001 KAPA UDI Primer Mixes, 1-96 96反応 ¥65,000
09329838001 KAPA UDI Primer Mixes, 97-192 96反応 ¥65,000
09329846001 KAPA UDI Primer Mixes, 193-288 96反応 ¥65,000
09329854001 KAPA UDI Primer Mixes, 289-384 96反応 ¥65,000

※価格は2022年4月現在のものです。

KAPA Universal Adapter & UDI Primer Mixes

インデックスホッピング対応 PCR ベースのデュアルインデックスアダプターキット

特長
  • KAPA独自のユニークなインデックス配列によりインデックス・ミスアサインメントの抑制に効果的です。
  • 下記のイルミナプラットフォームにご使用いただけます。
    パターンドフローセル:HiSeq™ 3000、HiSeq™ 4000、HiSeq™ X、NovaSeq™
    ノンパターンドフローセル:MiSeq™、NextSeq™、HiSeq™ 2000、HiSeq™ 2500
  • NGSでのQCバリデーション済み
  • イルミナプラットフォームでのインデックス設定用ファイルがございます。
  • 推奨ライブラリー調製キット
    DNA用:KAPA HyperPrep KitKAPA HyperPlus Kit
    RNA用:KAPA RNA HyperPrep Kit

KAPA ユニバーサルアダプター

  • Illuminaプラットフォーム上の次世代シーケンシング(NGS)用の短いアダプターです。
  • A-tailingステップの後、T-overhangsを付加し、ライブラリーフラグメントにライゲーションします。
  • サンプルバーコードは、ターゲットエンリッチメントに先立って、ライブラリー増幅ステップで組み込まれます。

KAPA ユニークデュアルインデックス(UDI)プライマーミックス

  • 最大384種類のインデックスに対応
  • KAPA UDI Primer Mixは、フォワードプライマーとリバースプライマーを事前に混合した組み合わせです。プライマーには、イルミナシーケンサーのインデックスミスアライメント(「インデックスホッピング」)を軽減するように設計された個別の8ヌクレオチドインデックスが含まれています。
  • KAPA ユニバーサルアダプターと組み合わせて使用し、次世代シーケンシング(NGS)用に個々のDNAサンプルから一意にインデックスが付加されたライブラリーを生成します。
  • 固有のインデックスを付加する事により、ターゲットキャプチャまたはクラスター生成の前にライブラリーをプールして、マルチプレックスシーケンスに適したライブラリー作製が可能となります。(また、KAPA HyperKit シリーズにも使用する事が可能です。)
Cat.No. 製品名 単位 価格
(税抜き)
09063781001 KAPA Universal Adapter, 15 µM, 960 µL 960 µL ¥11,000
09134336001 KAPA UDI Primer Mixes, 1-96 96反応 ¥65,000
09329838001 KAPA UDI Primer Mixes, 97-192 96反応 ¥65,000
09329846001 KAPA UDI Primer Mixes, 193-288 96反応 ¥65,000
09329854001 KAPA UDI Primer Mixes, 289-384 96反応 ¥65,000

※価格は2022年4月現在のものです。

FastGene™ Proof-Code(検体識別スパイクインDNA)

クリニカルシーケンスの精度管理に採用されています

特長
  • 公益財団法人かずさDNA研究所が保有する特許技術を製品化
  • 検体の取り違え、および検体間の相互汚染を検出し定量的に評価
  • Proof-Code入りチューブに検体(全血)を混ぜるだけのイージーユース

複数のサンプルを同時測定するのが一般的な次世代シーケンス(NGS)。
FastGene™ Proof-Codeは、以下のように日常的に起こりがちな問題を防止または発見するのに役立ちます。

  • 多くのサンプルを同時に処理することによって生じてしまうハンドリングミス
  • 使用機器における前回測定サンプルのキャリーオーバー
  • 各種試薬の汚染等が原因で生じる検体間のコンタミネーション等の有無の確認
仕様
  • NGSでのロットQC済み(バーコード配列およびコンタミチェック)
  • 1. 5 mLサンプリングチューブに分注済み、凍結乾燥処理で供給
  • 使用期限:製造後24か月
  • 保管温度:常温

Proof-Codeを用いたクリニカルシーケンスのフロー

Proof-Codeチューブに全血を入れるだけ。
DNA抽出の工程からProof-Codeの配列で取り違えやコンタミレベルを定量的に評価できます。

Cat.No. 製品名 単位 価格
(税抜き)
FG-PC-A FastGene™ Proof-Code(検体識別スパイクインDNA)セットA (96コード/ID #1-#96) 1セット ¥43,200
FG-PC-B FastGene™ Proof-Code(検体識別スパイクインDNA)セットB (96コード/ID #97-#192) 1セット ¥43,200
FG-PC-C FastGene™ Proof-Code(検体識別スパイクインDNA)セットC (96コード/ID #193-#288) 1セット ¥43,200
FG-PC-D FastGene™ Proof-Code(検体識別スパイクインDNA)セットD (96コード/ID #289-#384) 1セット ¥43,200
FG-PC-E FastGene™ Proof-Code(検体識別スパイクインDNA)セットE (384コード/ID #1-#384) 1セット ¥168,000

※価格は2022年4月現在のものです。

NEW! アクセサリー

Cat.No. 製品名 単位 価格
(税抜き)
FG-PC-X FastGene™ Proof-Code カウンタープローブ 1本 ¥9,600

※価格は2022年4月現在のものです。

NEW! KAPA HyperCap Oncology panel

がんゲノムプロファイリングなどに用いるKAPA HyperCapture用Oncologyパネル

腫瘍の体細胞遺伝子研究で使用される13の遺伝子などをターゲットにした総サイズ214 kb の領域をカバーするハイブリダイゼーションキャプチャー用パネルです。

パネルデザインと用途

  • 腫瘍の体細胞遺伝子検査で用いられる13の遺伝子(ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、EGFR、ERBB2、KRAS、MET、MYCN、RAD51C、RAD51D、
    TP53)をカバー
  • 67個の関連遺伝子に存在する変異ホットスポットもカバー
  • 様々な用途で使用可能:体細胞遺伝子変異研究のためのカタログパネルとして。カスタムパネルを使う前のパフォーマンス評価に。プロセス評価用パネルとして

低品質なFFPETサンプルからも精度の高いシーケンスが可能

  • FFPETサンプル由来のDNAからの専用のプロトコル(K APA HyperCapFFPET DNA ワークフロー)が利用可能
  • KAPA HyperCap FFPET DNAワークフローでは、分⼦バーコードKAPA Universal UMI(Unique Molecular Indexes)Adapterとライブラリー作製キットKAPA HyperPlus Kitを使用し、少量・低品質のFFPET DNAサンプルからでも精度の高いシーケンスを実現
Cat.No. 製品名 単位 価格
(税抜き)
09462384001 KAPA HyperCap Oncology panel 12 rxn 12反応 ¥180,000
09462457001 KAPA HyperCap Oncology panel 24 rxn 24反応 ¥300,000
09462465001 KAPA HyperCap Oncology panel 48 rxn 48反応 ¥530,000

※価格は2022年4月現在のものです。

NEW! KAPA HyperCap Heredity panel

遺伝性疾患プロファイリングなどに使用するKAPA HyperCapture用Heredityパネル

遺伝性疾患の研究に強く関連する3,332の遺伝子をカバーする10 Mbのハイブリダイゼーションキャプチャー用パネルです。
本製品を用いることで、Roche技術者によって厳選されたターゲットを、均一的かつ低い重複率で、効果的にシーケンスすることができます。

厳選されたターゲット(パネルデザイン)

  • 遺伝性疾患や遺伝性腫瘍に関わる3,332遺伝子に加え、ClinVarにpathogenic またはlikely pathogenicで登録されている遺伝子バリアントをカバー
  • シーケンス効率を上げる10 Mb以下のコンパクトデザイン
図1. 各主要ゲノムデータベースのKAPA HyperCap Heredity Panelによるカバー率

100 ngのgDNAを初発DNAとしてKAPA HyperCap Workflow v3でKAPA HyperCap
Heredity Panelによるターゲットシーケンスを実施した(96レプリケート、サンプル:NA12878)。
ライブラリー調製にはK APA HyperPrep Kitを使用し、12サンプルをプレプールして8回のハイブリダイゼーションを行った。NovaSeq™ 6000システムでシーケンスを行い、解析前に10 MのHQフィルタークラスターにダウンサンプリングした。ターゲット3,332遺伝子のうち、ACMG73、ENSEMBL、RefSeqのそれぞれに登録されている遺伝子領域の99%以上、ClinVar登録遺伝子領域の85%以上が、30 x以上のカバレッジでシーケンスされたことが示された。

Cat.No. 製品名 単位 価格
(税抜き)
09462473001 KAPA HyperCap Heredity panel 12 rxn 12反応 ¥290,000
09462481001 KAPA HyperCap Heredity panel 24 rxn 24反応 ¥520,000
09462490001 KAPA HyperCap Heredity panel 48 rxn 48反応 ¥900,000

※価格は2022年4月現在のものです。

NEW! KAPA HyperCap SARS-CoV-2 panel

COVID-19シーケンスに用いるKAPA HyperCapture用SARS-CoV-2パネル

特長
  • SARS-CoV-2リファレンスゲノム MN908947.3に対しデザインされたハイブリダイゼーションキャプチャー用プローブ
  • サイズ120 bpのビオチン化オリゴヌクレオチドで構成されています。
  • ターゲットサイズ~30 kbで、MN908947.3を100%カバーします。
  • その他GenBankに登録されている183種類についても、99.7%以上の領域をカバーします。
  • KAPAライブラリー作製キットと併せ使用します(『KAPA RNA HyperCap Workflow v1.0』に準拠)。
  • マルチプレックスキャプチャー対応(最大16 プレックスまで実績あり)
  • 内部コントロールとしてMS2 RNAを Spike-inした際に使用できるMS2 RNAターゲッティングプローブも含まれています。

わずか1000コピーで、SARS-CoV-2ゲノムの97%以上を1X coverageでカバー

ヒトRNA20 ngまたは100 ngに対し、図に示されたコピー数のウイルスを含むサンプルを使
用し、KAPA RNAHyperPrepおよびKAPA SARS-CoV-2 Target EnrichmentPanelでライブラリーを作製した結果(n=3、0.5 millon cluster, 2 x 75 bp)。
1,000コピー以上あれば、ほとんどすべてのゲノム領域をカバーできた。また、バックグラウンド(ヒトRNA)の影響は小さいことが示された。

均一なゲノムカバレッジ

KAPA SARS-CoV-2TE結果(緑色)を、エンリッチメントにPCRを用いるARTIC v3アンプリコンシーケンス法(New England Biolabs,灰色)と比較した結果。
KAPA SARS-CoV-2 TEでは、 全体的に均一なカバレッジをもたらした一方で、ARTICライブラリーのスパイク遺伝子では、ほぼ読み取りができない部分(黒枠)が観察された。

Cat.No. 製品名 単位 価格
(税抜き)
09436499001 KAPA HyperCap SARS-CoV-2 panel 12反応 ¥170,000
09436502001 KAPA HyperCap SARS-CoV-2 panel 24反応 ¥240,000
09436529001 KAPA HyperCap SARS-CoV-2 panel 48反応 ¥380,000

※価格は2022年4月現在のものです。

KAPA HyperExome kit

ヒト全エクソームエンリッチメント用キャプチャープローブ

特長
  • 重要な領域は取りこぼさない効率的なデザイン
  • データベースはCCDS、RefSeq、Ensembl、GENCODEを参照
  • キャプチャーの均一性が向上しました。
  • デュプリケーションレートが改善しました。
  • ターゲットカバレッジが向上しました。
  • 製造されたプローブは全てNGSでQCを行っています。
  • サンプルトラッキングSNPs(387)を含んでいます。
    混同や相互汚染などがあった場合にチェックが可能で、結果の信頼性が向上します。

KAPA HyperExomeは最高のシーケンス効率を示します

ターゲットに対する均一性と特異性の最適なバランスを実現

  • 高い均一性:シーケンススループットの最適な利用
  • 高い特異性:コンテンツの幅が広がり、より深いレベルでのカバレッジの向上
Cat.No. 製品名 単位 価格
(税抜き)
09062548001 KAPA HyperExome 12反応 ¥360,000
09062556001 KAPA HyperExome 24反応 ¥700,000
09062564001 KAPA HyperExome 48反応 ¥1,200,000

※価格は2022年4月現在のものです。

こちらのページでは、クリニカルシーケンス対象製品のほかライブラリー作製技術ポイント等もご紹介しています。

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