クリニカルシーケンス関連新製品が続々登場
クリニカルシーケンスは、次世代シーケンサー（NGS）を用いて、患者個々の疾患関連遺伝子情報を解析する医療検査方法です。
クリニカルシーケンスとしてNGSを医療現場で使用するためには、正確かつ効率的にゲノムライブラリーを作製する必要があります。
本記事では、クリニカルシーケンスに関連する技術が採用された製品をご紹介します。
NEW！KAPA EvoPlus Kit
NEW！KAPA Universal UMI Adapter
KAPA Universal Adapter & UDI Primer Mixes
NEW！KAPA HyperCap Oncology panel
NEW！KAPA HyperCap Heredity panel
NEW！KAPA HyperCap SARS-CoV-2 panel
KAPA HyperExome kit
こちらのページでは、クリニカルシーケンス対象製品のほか「ライブラリー作製技術ポイント」等もご紹介しています。
NEW！ KAPA EvoPlus Kit
アップグレードされた断片化酵素ミックスにより、さまざまな課題を解決します。
- アーティファクト（人工的な変異）の発生を低減
- EDTAなどインヒビターの影響による断片化サイズのばらつきを改善
- フラグメンテーションとAテーリングを統合した簡便なステップ
- 操作時間を短縮（おおよそ２時間）
- サンプルインプットレンジは10 ng ～ 500 ng（PCRフリーライブラリーは 75 ng以上から可能）*
- プレートフォーマットタイプを新しく追加、完全に自動化可能なワークフローをご提供します。
*全ゲノムシーケンス、高品質gDNA、ダブルサイズセレクションをしていない、フルレングスアダプターを使用する、などの条件を満たす必要があります。
ストランドスプリットアーティファクトリード（SSARs）の抑制
KAPA EvoPlus Kit、KAPA HyperPrep Kit、NEBNext® U ltra™ I I F S、QIAseq F Xで500 ngのヒトゲノムからライブラリーを調製し（ダブルサイズセレクションを実行）、SSARs（キメラリードの1種であり、部分的に連続しないゲノム配列で構成されるリード）の割合を調べたところ、NEBNext® Ultra™ II FS、QIAseq FXキットではSSARsが存在する割合が高くなっているのに対して、KAPA EvoPlusライブラリーに存在するSSARsの割合は、機械的に断片化されたKAPA HyperPrepライブラリーと同等であり、ゼロに近いことが確認されました（0.002％）。
キメラの抑制
KAPA EvoPlus Kit、KAPA HyperPrep Kit、NEBNext Ultra™ II FS、QIAseq FXで500 ngのヒトゲノムからライブラリーを調製し（ダブルサイズセレクションを実行）、キメラリードの割合を調べたところ、KAPA EvoPlusライブラリーに存在するキメラの割合はKAPA HyperPrepライブラリーと同等のレベルで低いことが示されました。
さまざまな投入量で再現性のある酵素的断片化が可能
ヒトゲノムDNA（10 ng、100 ng、500 ng）を37℃で断片化したところ、いずれの条件においてもモードインサートサイズが約300 bpのライブラリーが調製されることが示されました。この検証実験ではフルレングスアダプター（KAPA UDIアダプター）を用いたKAPA EvoPlusワークフローを実施し（サイズセレクションなし）、2サイクルの増幅を行ったものをLabChip GX Touch HTとHT DNA HiSens Reagent Kit（PerkinElmer）で泳動しました。
ゲノムDNA溶液のバッファーの種類に関わらず再現性のある酵素的断片化が可能
10 mM Tris-HClまたは10 mM Tris-HCl、1 mM EDTAに溶解したヒトゲノムDNA（500 ng）を37℃で断片化したところ、どちらの条件においてもモードインサートサイズが約300 bpのライブラリーが調製されることが示されました。この検証実験ではフルレングスアダプター（KAPA UDIアダプター）を用いたKAPA EvoPlusワークフローを実施し（サイズセレクションなし）、2サイクルの増幅を行ったものをLabChip GX Touch HTとHT DNA HiSens Reagent Kit（PerkinElmer）で泳動しました。
断片化とAテーリングを統合した「Frag Tail Step」を採用
KAPA EvoPlusキットは、ゲノムDNA断片化からAテーリング までを１つのステップに統合し、ワークフローを大幅に簡略化しました。（Frag Tail Step）
また、試薬はレディミックスで供給されますのでライブラリー調製の準備はよりシンプルになります。
しかも、Frag Tail Stepからアダプターライゲーションの間にクリーンナップがありませんので、磁気ビーズでの精製が省略できます。
プレートフォーマット製品を選択いただくと、各ウェルに試薬が分注された状態で供給されますので、ライブラリー調製を自動で行っていらっしゃる方にも適したキットです。
チューブフォーマット
| Cat.No. | 製品名 | 単位 | 価格 （税抜き） |
|---|---|---|---|
| 09420037001 | KAPA EvoPlus Kit※1 | 24反応 | ￥118,000 |
| 09420045001 | KAPA EvoPlus Kit （PCRフリー） | 24反応 | ￥112,000 |
| 09420053001 | KAPA EvoPlus Kit※1 | 96反応 | ￥398,000 |
| 09420304001 | KAPA EvoPlus Kit （PCRフリー） | 96反応 | ￥380,000 |
| 09420339001 | KAPA EvoPlus Kit※2 | 384反応 | ￥1,528,000 |
| 09420371001 | KAPA EvoPlus Kit （PCRフリー） | 384反応 | ￥1,468,000 |
| 09420410001 | KAPA Library Amp Primer Mix | 384反応 | ￥36,000 |
※1 KAPA Library Amp Primer Mix（Cat.No. KK2623） 無償添付
※2 KAPA Library Amp Primer Mix（Cat.No. 09420410001） 無償添付
※価格は2022年4月現在のものです。
プレートフォーマット
| Cat.No. | 製品名 | 単位 | 価格 （税抜き） |
|---|---|---|---|
| 09420428001 | KAPA EvoPlus Kit（ プレートフォーマット）※3 | 96反応 | ￥458,000 |
| 09420436001 | KAPA EvoPlus Kit （プレートフォーマット/PCRフリー） | 96反応 | ￥437,000 |
| 09420479001 | KAPA Library Amp Primer Mix （プレートフォーマット） | 96反応 | ￥12,000 |
※3 KAPA Library Amp Primer Mix（Cat.No. 09420479001） 無償添付
※価格は2022年4月現在のものです。
NEW！ KAPA Universal UMI Adapter
Roche 固有の分子バーコード（Unique Molecular Indexes）を含むイルミナプラットフォーム用アダプター
本製品とKAPA ユニークデュアルインデックス（UDI）プライマーミックスを共に使⽤することで、分⼦バーコード付きのライブラリーを調製する事ができます。
各サンプルに付加した分⼦バーコードを解析することで、異なるリードを適切に判別することが可能となり、低頻度のバリアント検出の精度をさらに⾼めることができます。
低頻度変異の解析に必要な低エラー率を実現
独自の二本鎖バーコーディングを採用
⼀本鎖からなる分⼦バーコードと⽐較して、⾮常に低いエラー率を実現することができます。また、本製品による分子バーコード配列はインサート配列のすぐ隣に導⼊されるので、PCRによるキメラの発⽣頻度が低く、マッピングされないリードの割合を最小限にします。このため、効率の良いシーケンスを実現します。
慎重に設計された16種の配列既知の分子タグ
本製品は、ランダム配列の分子バーコードではなく慎重に選択した16種の既知配列の分⼦バーコードを使⽤しています。このため、バーコード上に⽣じたエラーは解析の際に除外できます。また、フラグメントの両側に付加する⽅式を採⽤しているため、16×16＝256種類の分子が識別できます。解析時には、それぞれのフラグメントのスタート位置とエンド位置も考慮してユニーク分⼦を判別しますので、⼗分な感度での解析が可能です。
データ解析時にin silicoでオリジナルの⼆本鎖の配列を作成（再現）します。
（Integrated digital error suppression for ultrasensitive detection of circulating tumor DNA Nat Biotechnol. 2016 34:547-555.より改変）
| Cat.No. | 製品名 | 単位 | 価格 （税抜き） |
|---|---|---|---|
| 09329862001 | KAPA Universal UMI Adapter, 960 µL | 96反応 | ￥72,000 |
| 09134336001 | KAPA UDI Primer Mixes, 1-96 | 96反応 | ￥65,000 |
| 09329838001 | KAPA UDI Primer Mixes, 97-192 | 96反応 | ￥65,000 |
| 09329846001 | KAPA UDI Primer Mixes, 193-288 | 96反応 | ￥65,000 |
| 09329854001 | KAPA UDI Primer Mixes, 289-384 | 96反応 | ￥65,000 |
※価格は2022年4月現在のものです。
KAPA Universal Adapter & UDI Primer Mixes
インデックスホッピング対応 PCR ベースのデュアルインデックスアダプターキット
- KAPA独自のユニークなインデックス配列によりインデックス・ミスアサインメントの抑制に効果的です。
- 下記のイルミナプラットフォームにご使用いただけます。
パターンドフローセル：HiSeq™ 3000、HiSeq™ 4000、HiSeq™ X、NovaSeq™
ノンパターンドフローセル：MiSeq™、NextSeq™、HiSeq™ 2000、HiSeq™ 2500 - NGSでのQCバリデーション済み
- イルミナプラットフォームでのインデックス設定用ファイルがございます。
- 推奨ライブラリー調製キット
DNA用：KAPA HyperPrep Kit、KAPA HyperPlus Kit
RNA用：KAPA RNA HyperPrep Kit
KAPA ユニバーサルアダプター
- Illuminaプラットフォーム上の次世代シーケンシング（NGS）用の短いアダプターです。
- A-tailingステップの後、T-overhangsを付加し、ライブラリーフラグメントにライゲーションします。
- サンプルバーコードは、ターゲットエンリッチメントに先立って、ライブラリー増幅ステップで組み込まれます。
KAPA ユニークデュアルインデックス（UDI）プライマーミックス
- 最大384種類のインデックスに対応
- KAPA UDI Primer Mixは、フォワードプライマーとリバースプライマーを事前に混合した組み合わせです。プライマーには、イルミナシーケンサーのインデックスミスアライメント（「インデックスホッピング」）を軽減するように設計された個別の8ヌクレオチドインデックスが含まれています。
- KAPA ユニバーサルアダプターと組み合わせて使用し、次世代シーケンシング（NGS）用に個々のDNAサンプルから一意にインデックスが付加されたライブラリーを生成します。
- 固有のインデックスを付加する事により、ターゲットキャプチャまたはクラスター生成の前にライブラリーをプールして、マルチプレックスシーケンスに適したライブラリー作製が可能となります。(また、KAPA HyperKit シリーズにも使用する事が可能です。)
| Cat.No. | 製品名 | 単位 | 価格 （税抜き） |
|---|---|---|---|
| 09063781001 | KAPA Universal Adapter, 15 µM, 960 µL | 960 µL | ￥11,000 |
| 09134336001 | KAPA UDI Primer Mixes, 1-96 | 96反応 | ￥65,000 |
| 09329838001 | KAPA UDI Primer Mixes, 97-192 | 96反応 | ￥65,000 |
| 09329846001 | KAPA UDI Primer Mixes, 193-288 | 96反応 | ￥65,000 |
| 09329854001 | KAPA UDI Primer Mixes, 289-384 | 96反応 | ￥65,000 |
※価格は2022年4月現在のものです。
NEW！ KAPA HyperCap Oncology panel
がんゲノムプロファイリングなどに用いるKAPA HyperCapture用Oncologyパネル
腫瘍の体細胞遺伝子研究で使用される13の遺伝子などをターゲットにした総サイズ214 kb の領域をカバーするハイブリダイゼーションキャプチャー用パネルです。
パネルデザインと用途
- 腫瘍の体細胞遺伝子検査で用いられる13の遺伝子（ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、EGFR、ERBB2、KRAS、MET、MYCN、RAD51C、RAD51D、
TP53）をカバー - 67個の関連遺伝子に存在する変異ホットスポットもカバー
- 様々な用途で使用可能：体細胞遺伝子変異研究のためのカタログパネルとして。カスタムパネルを使う前のパフォーマンス評価に。プロセス評価用パネルとして
低品質なFFPETサンプルからも精度の高いシーケンスが可能
- FFPETサンプル由来のDNAからの専用のプロトコル（K APA HyperCapFFPET DNA ワークフロー）が利用可能
- KAPA HyperCap FFPET DNAワークフローでは、分⼦バーコードKAPA Universal UMI（Unique Molecular Indexes）Adapterとライブラリー作製キットKAPA HyperPlus Kitを使用し、少量・低品質のFFPET DNAサンプルからでも精度の高いシーケンスを実現
| Cat.No. | 製品名 | 単位 | 価格 （税抜き） |
|---|---|---|---|
| 09462384001 | KAPA HyperCap Oncology panel 12 rxn | 12反応 | ￥180,000 |
| 09462457001 | KAPA HyperCap Oncology panel 24 rxn | 24反応 | ￥300,000 |
| 09462465001 | KAPA HyperCap Oncology panel 48 rxn | 48反応 | ￥530,000 |
※価格は2022年4月現在のものです。
NEW！ KAPA HyperCap Heredity panel
遺伝性疾患プロファイリングなどに使用するKAPA HyperCapture用Heredityパネル
遺伝性疾患の研究に強く関連する3,332の遺伝子をカバーする10 Mbのハイブリダイゼーションキャプチャー用パネルです。
本製品を用いることで、Roche技術者によって厳選されたターゲットを、均一的かつ低い重複率で、効果的にシーケンスすることができます。
厳選されたターゲット（パネルデザイン）
- 遺伝性疾患や遺伝性腫瘍に関わる3,332遺伝子に加え、ClinVarにpathogenic またはlikely pathogenicで登録されている遺伝子バリアントをカバー
- シーケンス効率を上げる10 Mb以下のコンパクトデザイン
100 ngのgDNAを初発DNAとしてKAPA HyperCap Workflow v3でKAPA HyperCap
Heredity Panelによるターゲットシーケンスを実施した（96レプリケート、サンプル：NA12878）。
ライブラリー調製にはK APA HyperPrep Kitを使用し、12サンプルをプレプールして8回のハイブリダイゼーションを行った。NovaSeq™ 6000システムでシーケンスを行い、解析前に10 MのHQフィルタークラスターにダウンサンプリングした。ターゲット3,332遺伝子のうち、ACMG73、ENSEMBL、RefSeqのそれぞれに登録されている遺伝子領域の99%以上、ClinVar登録遺伝子領域の85%以上が、30 x以上のカバレッジでシーケンスされたことが示された。
| Cat.No. | 製品名 | 単位 | 価格 （税抜き） |
|---|---|---|---|
| 09462473001 | KAPA HyperCap Heredity panel 12 rxn | 12反応 | ￥290,000 |
| 09462481001 | KAPA HyperCap Heredity panel 24 rxn | 24反応 | ￥520,000 |
| 09462490001 | KAPA HyperCap Heredity panel 48 rxn | 48反応 | ￥900,000 |
※価格は2022年4月現在のものです。
NEW！ KAPA HyperCap SARS-CoV-2 panel
COVID-19シーケンスに用いるKAPA HyperCapture用SARS-CoV-2パネル
- SARS-CoV-2リファレンスゲノム MN908947.3に対しデザインされたハイブリダイゼーションキャプチャー用プローブ
- サイズ120 bpのビオチン化オリゴヌクレオチドで構成されています。
- ターゲットサイズ~30 kbで、MN908947.3を100％カバーします。
- その他GenBankに登録されている183種類についても、99.7％以上の領域をカバーします。
- KAPAライブラリー作製キットと併せ使用します（『KAPA RNA HyperCap Workflow v1.0』に準拠）。
- マルチプレックスキャプチャー対応（最大16 プレックスまで実績あり）
- 内部コントロールとしてMS2 RNAを Spike-inした際に使用できるMS2 RNAターゲッティングプローブも含まれています。
わずか1000コピーで、SARS-CoV-2ゲノムの97%以上を1X coverageでカバー
ヒトRNA20 ngまたは100 ngに対し、図に示されたコピー数のウイルスを含むサンプルを使
用し、KAPA RNAHyperPrepおよびKAPA SARS-CoV-2 Target EnrichmentPanelでライブラリーを作製した結果（n=3、0.5 millon cluster, 2 x 75 bp）。
1,000コピー以上あれば、ほとんどすべてのゲノム領域をカバーできた。また、バックグラウンド（ヒトRNA）の影響は小さいことが示された。
均一なゲノムカバレッジ
KAPA SARS-CoV-2TE結果（緑色）を、エンリッチメントにPCRを用いるARTIC v3アンプリコンシーケンス法（New England Biolabs,灰色）と比較した結果。
KAPA SARS-CoV-2 TEでは、 全体的に均一なカバレッジをもたらした一方で、ARTICライブラリーのスパイク遺伝子では、ほぼ読み取りができない部分（黒枠）が観察された。
| Cat.No. | 製品名 | 単位 | 価格 （税抜き） |
|---|---|---|---|
| 09436499001 | KAPA HyperCap SARS-CoV-2 panel | 12反応 | ￥170,000 |
| 09436502001 | KAPA HyperCap SARS-CoV-2 panel | 24反応 | ￥240,000 |
| 09436529001 | KAPA HyperCap SARS-CoV-2 panel | 48反応 | ￥380,000 |
※価格は2022年4月現在のものです。
KAPA HyperExome kit
ヒト全エクソームエンリッチメント用キャプチャープローブ
- 重要な領域は取りこぼさない効率的なデザイン
- データベースはCCDS、RefSeq、Ensembl、GENCODEを参照
- キャプチャーの均一性が向上しました。
- デュプリケーションレートが改善しました。
- ターゲットカバレッジが向上しました。
- 製造されたプローブは全てNGSでQCを行っています。
- サンプルトラッキングSNPs（387）を含んでいます。
混同や相互汚染などがあった場合にチェックが可能で、結果の信頼性が向上します。
KAPA HyperExomeは最高のシーケンス効率を示します
ターゲットに対する均一性と特異性の最適なバランスを実現
- 高い均一性：シーケンススループットの最適な利用
- 高い特異性：コンテンツの幅が広がり、より深いレベルでのカバレッジの向上
| Cat.No. | 製品名 | 単位 | 価格 （税抜き） |
|---|---|---|---|
| 09062548001 | KAPA HyperExome | 12反応 | ¥360,000 |
| 09062556001 | KAPA HyperExome | 24反応 | ¥700,000 |
| 09062564001 | KAPA HyperExome | 48反応 | ¥1,200,000 |
※価格は2022年4月現在のものです。
こちらのページでは、クリニカルシーケンス対象製品のほかライブラリー作製技術ポイント等もご紹介しています。
