日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？

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下記フィードバックは、
千葉大学真菌医学研究センター 真菌症研究部門分野 微生物資源分野 高橋弘喜様
千葉大学大学院医学研究院 皮膚科学 松岡悠美様
千葉大学大学院薬学研究院 微生物薬品化学 高屋明子様の御厚意により掲載させていただきました。

背景

黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は、ヒトや動物の皮膚、消化管に存在する細菌の1つです。これらの菌のゲノム配列を解析することは、病原性を高める遺伝子変異などの解明や、抗生物質耐性菌の解析に有用です。
当研究室では、これらの黄色ブドウ球菌の細菌ゲノムの次世代シーケンスをする際に、短期間で非常に多くの検体数を解析する必要がありました。
そこで、断片化処理から1チューブ中でライブラリ作製可能であるKAPA HyperPlus Kitを用いることにより、短期間で非常に多くの検体を解析した一例をご紹介します。

実験条件

●サンプルDNA
　生物種　　　　　　　       ： 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）
　サンプルの精製キット       ： NucleoSpin Tissue（MACHREY-NAGEL, TaKaRa・ #740952.250）
　Input DNA量　　　　        ： 250 ngまたは100 ng　　
　Input DNAバッファー組成 ： 5mM Tris/HCl, pH 8.5でeluteしたDNAを、10mM Tris/HCl pH 8.5（illuminaのResuspension Buffer）で一定濃度に希釈
＜断片化条件＞　
　・反応温度                         ： 37℃ 
　・反応時間 　　　　          ：13 min
　・Target size 　　　　　　：500-800 bp
　アダプターの濃度               ：15uM
　PCRサイクル数                  ：5サイクル（250 ng）または6サイクル（100 ng）

【黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のイメージ図】

多検体サンプルのライブラリ作製方法

【KAPA HyperPlus Kit】
dsDNA sample (35uL)
　　　　　↓
（KAPA Frag酵素によるDNAの断片化）
Enzymatic Fragmentation (50uL)　5‐40min. at 37℃ Transfer to 4℃
　　　　　↓
End Repair and A‐tailing (60uL) 30min. at 65℃
　　　　　↓
Adapter Ligation (110uL) 15min. at 20℃
　　　　　↓
Post‐ligation Cleanup (198uL) 0.8x SPRI
　　　　　↓
Library Amplification (50uL)
　　　　　↓
Post‐amplification Cleanup (100uL) 1xSPRI
　　　　　↓
Qubit 3.0 Fluorometer（ThermoFisher Scientific・Q33216）により濃度を測定
　　　　　↓
Bioanalyzer によるサイズ確認
　　　　　↓
＜多検体サンプルのサイズセレクション＞
＊24サンプルの濃度をそれぞれ測定し、同一濃度に揃えた上で、混合して電気泳動を行った

<電気泳動によるサイズセレクション Target size：550-650bp>
濃度調製後、24 サンプルの混合
　　　　　↓
　　　ゲル抽出
　　　　　↓
【KAPA Library Quantification Kit】
Qubit とリアルタイムPCR により濃度測定
　　　　　↓
illumina MiSeq でNGS 解析

ライブラリ作製後のBioanalyzerによるサイズ確認の結果

ライブラリの評価

＜FASTQC データ＞
Per base sequence quality

Per base sequence content

（リード長：292.7138）　　　　　　　　　　　　　　　

　　
（リード長：294.0939）

お客様のコメント

黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の細菌ゲノムの次世代シーケンスをする際に、短期間で非常に多くの検体数（500）を解析する必要があったため、酵素による断片化試薬が含まれており、1チューブでライブラリ作製が可能である本試薬を試しました。
KAPA HyperPlus Kit は、他社ライブラリキットと比較した結果、断片化バイアスが低減し、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のゲノム解析に十分なデータを得ることができました。

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