【お客様事例】初代培養マウス肝細胞におけるIFNγ誘導性IDO （インドールアミン2,3 ジオキシゲナーゼ）のsiRNAによるノックダウン効果の検証

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アプリケーションノート 2014<17>

製品名：KAPA HiFi HotStart ReadyMix（KK2601）
メーカー名：KAPA BIOSYSTEMS 社

以下のアプリケーションデータは武蔵野大学薬学部免疫学研究室小谷仁司様のご厚意により掲載させていただきました。

方法

テンプレートｃDNAの調製

マウスから採取したプライマリーhepatocyteを各種刺激（IFNγやsiRNA）した後、RNAを抽出した。
1000 ngのtotal RNAをcDNAに逆転写した後、反応液の1/25量をテンプレートとして使用した。（40 ngのtotalRNA由来のcDNA）

試薬組成

＜KAPA HiFi＞
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 　12.5μL
Forward primer（10μM）　　　　 0.75μL
Reverse primer（10μM） 0.75μL
Template cDNA 2μL
PCR grade water 9μL
Total 25μL

＜To社高正確性酵素＞
DNAポリメラーゼ　　　0.5μL
2mM dNTP 　　　　　　2.5μL
10×PCR buffer 　　　　 2.5μL
25mM MgSO4 1μL
Forward primer（10μM） 0.75μL
Reverse primer（10μM） 0.75μL
Template cDNA 2μL
PCR grade water 15μL
Total 25μL

サイクルプログラム

＜KAPA HiFi＞

＜To社高正確性酵素＞

● 増幅サイズ　1200bp 　
● 使用PCR 装置：TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice standard

結果

IFNγ誘導性のIDO（インドールアミン2,3 ジオキシゲナーゼ）をsiRNAによりノックダウンした効果について、PCRにて検証を行なった。
KAPA HiFi HotStart ReadyMixでは、IFNγ誘導性IDOのバンドの検出、およびsiRNAのノックダウンによるバンドの消失が確認された。