日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？
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| アプリケーションノート 2018＜19＞ 製品名：FastGene™ Scriptase Ⅱ（NE-LS53） メーカー名：日本ジェネティクス株式会社 |
下記のデータは、国内公的研究機関 田村 拓 様のご厚意により掲載させていただきました。
FastGene™ Scriptase Basicの性能評価を行うため、HeLa 細胞から抽出
したRNAを、本製品と既存の逆転写酵素にて、それぞれ逆転写反応を
行いました。
得られたcDNAは、PCRにてターゲット遺伝子を増幅し、電気泳動にて
確認を行いました。
バンドのシグナルを比較することで、FastGene™ Scriptase Basicの
性能評価を行いました。
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FastGene™ ScriptaseⅡの性能評価を行うため、HeLa 細胞から抽出した RNAを、本製品と既存の逆転写酵素にて、それぞれ逆転写反応を行いました。 得られたcDNAは、PCRにてターゲット遺伝子を増幅し、電気泳動にて確認を行いました。 バンドのシグナルを比較することで、 FastGene™ ScriptaseⅡの性能評価を行いました。 |
概要
FastGene™ ScriptaseⅡの性能評価を行うため、HeLa 細胞から抽出したRNAを、本製品と既存の逆転写酵素にて、それぞれ逆転写反応を行いました。
得られたcDNAは、PCRにてターゲット遺伝子を増幅し、電気泳動にて確認を行いました。
バンドのシグナルを比較することで、 FastGene™ ScriptaseⅡの性能評価を行いました。
実験
● RNA抽出
サンプル：HeLa 細胞を35 mm dish で培養し 80-90% confluent の時点で使用した。
RNA抽出：Ribozol（エムエステクノシステムズ）（N580-100ML ）
吸光度測定：U-3900（ HITACHI ）（U-3900）
結果：A260/280=1.72, yield=41.5 μg
● 逆転写酵素反応
Total RNAを1, 10, 100 ng/1 μLとなるように希釈した。それぞれTemplate RNAとして1 μLずつ添加した。
※ 0 ngは1 μL H2O
● 逆転写反応 Primer
Gene specific primer（GAPDH）： CTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC
Template RNA（0, 1, 10, 100 ng/μL） ： 1 μL
Gene specific primer（ GAPDH） ： 2 μL（2 pmol）
dNTP Mixture（2 mM each） ： 2 μL
Sterile water（ RNase free） ： 7.5 μL
total ： 12.5 μL
↓
65 ℃ 5 min
↓
4 ℃ 5 min
↓
add
5X FastGene™ Scriptase Ⅱ buffer ： 4 μL
0.1 M DTT（ kit付属） ： 2 μL
FastGene™ Scriptase Ⅱ ： 1 μL
↓
42 ℃ 50 min
↓
70 ℃ 15 min
↓
keep at 22 ℃
参考：Template total RNA推奨量：1 ng-5 μg
Template RNA（0, 1, 10, 100 ng/μL） ： 1 μL
Gene specific primer（ GAPDH） ： 2 μL（2 pmol）
2 mM dNTP ： 5 μL
RNase free dH2O ： 2 μL
total ： 10 μL
↓
65 ℃ 5 min
↓
4 ℃ 5 min
↓
add
5X buffer ：4 μL
逆転写酵素 ：1 μL
RNase free dH2O ：5 μL
↓
42 ℃ 50 min
↓
70 ℃ 15 min
↓
keep at 22 ℃
参考：Template total RNA推奨量：5 μg以下
PCR条件
| ● 反応組成 | ||
| 10 μM Forward Primer | ： | 2.5 μL |
| 10 μM Reverse Primer | ： | 2.5 μL |
| 2 mM dNTPs（TOYOBO） | ： | 5 μL |
| 5X Phusion HF Buffer | ： | 10 μL |
| cDNA | ： | 2 μL |
| sterile water | ： | 27.5 μL |
| total ： 50 μL | ： | 50 μL |
● プログラム
| 95 ℃ | 2 min | ||
| ↓ | |||
| 95 ℃ | 10 sec |  |
30 cycles |
| 65 ℃ | 30 sec | ||
| 72 ℃ | 30 sec | ||
| ↓ | |||
| 72 ℃ | 3 min | ||
| ↓ | |||
| hold | 22 ℃ |
● Primers 配列-GAPDH
| Forward Primer | ：CCACAGTCCATGCCATCAC |
| Reverse Primer | ：CCATGAGGTCCACCACCC |
| 増幅産物サイズ | ：500bp |
電気泳動条件
| アガロースゲル | ： | 1% agarose gel |
| サンプル | ： | PCR 反応液 15 μL |
| 泳動バッファー | ： | 1xTAE |
| 泳動条件 | ： | 100 V, 30 min |
| ラダーマーカー | ： | 7 μL（Gene Ladder Wide 1）（日本ジーン）（313-06961） |
結果
Scriptase Ⅱ T 社
- こちらのアプリケーションノートのPDFダウンロード ： こちら
- 製品情報詳細ページ： FastGene™ Scriptase Ⅱ
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大量のサンプルを解析できる逆転写酵素を探していました。
少ないtotal RNA量で逆転写ができ、満足しています。