【お客様事例】フェノール抽出試薬とスピンカラム法を用いたFastGene™ miRNA Enhancerの有用性

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アプリケーションノート 2020<04>
製品名:FastGene™ miRNA Enhancer(Cat.No.FG-RNAE-S, FG-RNAE-25)
    FastGene™ RNA Premium kit(Cat.No.FG-81006, FG-81050, FG-81250)
メーカー名:日本ジェネティクス株式会社

製品名:TRIsure(Cat.No.BIO-38032)
メーカー名:BIOLINE社

下記データは、社会医療法人大雄会医科学研究所 澤村 卓宏 様のご厚意により掲載させていただきました。

概要

FastGene™ miRNA Enhancerは、市販のカラム法を用いたRNA抽出キットと組み合わせることによって、miRNAの効果的な回収を可能にする試薬です。これまで、FastGene™ RNA Premium kit のような非フェノール法を用いた抽出方法において使用実績がありましたが、酸性フェノール法を用いた抽出法での効果が得られるかは未知でした。
本アプリケーションノートでは、FastGene™ RNA Premium kit の抽出工程を、 TRIsureを用いた酸性フェノール抽出法で行い* 、 miR-21のターゲットにその収量評価を行いました。
その結果、FastGene™ miRNA Enhancerは、TRIsure を用いた抽出においても、miR-21回収量を増加させることがわかりました。
* 本アプリケーションノート記載のmiRNA抽出方法は、FastGene™ RNA Premium kit およびFastGene™ RNA Basic Kitでご使用いただけます。

実験条件

細胞
 細胞株 K562
 細胞数105 個調整したペレット(n=2)
RNA抽出方法
 巻末補足情報に記載
RNA収量/純度測定方法
 吸光光度計、DeNovix DS-11使用 
RNA回収量検証方法
 RT-qPCRにて検証(詳細は巻末補足情報に記載)

サンプル情報

サンプル 抽出 カラム精製 FastGene™
miRNA
Enhancer
Kit 抽出
+ Kit 精製
+ Enhancer(ー)
FastGene™
RNA Premium kit
  未添加
Kit 抽出
+ Kit 精製
+ Enhancer(+)
FastGene™
RNA Premium kit
  添加
TRI
+ Kit 精製
+ Enhancer(ー)
TRIsure FastGene™
RNA Premium kit
未添加
TRI
+ Kit 精製
+ Enhancer(+)
TRIsure FastGene™
RNA Premium kit
添加
TRI
+ EtOH purification
TRIsure 使用せず
(エタ―ノール沈殿のみ)
使用せず


使用キット・試薬

 

 
FastGene™ miRNA Enhancer
お手持ちのRNAキットに加えるだけで、miRNAを効率的に回収することができる試薬。
※ 本製品はスピンカラムを用いた抽出法において、カラムの担体に対してsmall RNAの結合を促進するものです。

 

 
FastGene™ RNA Premium kit
「高品質を低価格で」がコンセプトFastGene™製RNA精製キット。

 

 
TRIsure
フェノール含有RNA抽出試薬。

結果

結果1:抽出RNAの純度・収量比較

サンプル 吸光度測定結果
A260 260/280 260/230 濃度
(ng/μL)
収量
(μg)
Kit 抽出
+ Kit 精製
+ Enhancer(ー)
1.03 2.18 2.68 41.13 2.06
1.41 2.18 2.64 56.42 2.82
Kit 抽出
+ Kit 精製
+ Enhancer(+)
0.74 2.19 2.64 29.71 1.49
0.84 2.18 2.50 33.68 1.68
TRI
+ Kit 精製
+ Enhancer(ー)
0.67 2.20 2.31 26.80 1.34
0.63 2.01 1.75 25.19 1.26
TRI
+ Kit 精製
+ Enhancer(+)
0.95 2.22 2.59 37.86 1.89
0.94 2.18 2.38 37.61 1.88
TRI
+ EtOH purification
2.00 1.60 1.98 80.02 4.00
2.13 1.61 1.78 85.24 4.26
※各2回抽出精製(n=2)

• FastGene™ RNA Premium kit 付属のカラム精製を用いた場合(サンプル①~④)は、純度が高く(260/280 、2.0以上)、収量は1.2 μg ~2.8 μg の範囲で回収された。
• カラム精製を行わなかった条件(サンプル⑤)は、RNA純度が低い。
• FastGene™ RNA Premium kitを用いて場合、TRIsureを用いた場合共に、 miRNA Enhancer 添加の有無で、RNA抽出の純度に顕著な差は見られなかった(サンプル①と②、③と④の比較)。

 
 
結果2:回収したDNA溶液中(総量50 μL)に含まれるRNA量
(i) RT-qPCR結果
(GAPDH)
(ii)RT-qPCR結果
(miR-21)
※各2回(抽出精製、n=2)の平均値として表示
• miRNA Enhancer 添加前後で、GAPDH mRNAの回収量に顕著な差は見られなかった(結果2(i)) 。
• FastGene™ RNA Premium kit に従い抽出した場合(kit 抽出)、TRIsure を使用し抽出した場合共に、 miR-21収量は大きく増加した(結果2(ii)) 。
→ miRNA Enhancer の効果は、フェノール抽出法においても、遜色なく得られた。
 

結論

miRNA Enhancerは、miRNAの収量を大きく増加させることが確認できたことに加え、本製品は、酸性フェノール抽出法を用いるTRIsure使用時においても有用な手段となることが示された。

お客様のコメント
TRI sureは簡便にRNAが抽出可能でとても身近な試薬です。これを組み合わせることでより多くのマイクロRNAの収量が得られました。
 

補足説明

(i):RNA抽出・精製方法詳

リアルタイムPCRの条件

miR-21解析に用いたステムループRTプライマーとcDNA合成

miR-21解析に用いたリアルタイムPCR時のプライマー配列、プローブ、反応条件および反応液

 

GAPDH遺伝子のcDNA合成

GAPDH遺伝子解析に用いたプライマー配列、反応条件および反応液

 

 

 

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