【お客様事例】KAPA HiFi HotStart 酵素を用いた 少数T細胞(25~400個)からの遺伝子増幅

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アプリケーションノート 2016<13>
製品名:KAPA HiFi HotStart ReadyMix(KK2601)
メーカー名:KAPA BIOSYSTEMS 社

下記のデータは、日本学術振興会特別研究員PD 大阪大谷大学薬学部免疫学講座 池渕 良洋 様のご厚意により掲載させていただきました。

方法

少数T細胞群の遺伝子配列を調べるため、T細胞溶解液からcDNAを合成し、PCRにより遺伝子の増幅を行った。

● サンプルの条件

Template  
No1 T細胞400個分のcDNA溶液
No2 T細胞100個分のcDNA溶液
No3 T細胞 25個分のcDNA溶液
No4 Negative Control (T細胞なし)

T 細胞溶解液:0.2%TritonX-100

● PCR reaction mixture
<KAPA>                                        (µL)
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix  7.5
Primer A              0.6
Primer B                                           0.6
DDW                                                2.3
Template                                             4
Total                                               15μL

● PCR condition
<KAPA>
98℃   3 min
98℃   20 sec  ×5
72℃   45 sec
98℃   20 sec
70℃  15 sec   ×5
72℃   45 sec
98℃   20 sec
68℃   15 sec  ×25
72℃   45 sec
72℃   5 min
4℃    ∞


<TO社製品> 
             (µL)
×10 PCR Buffer    1.5
2mM dNTPs       1.5
25mM MgSO4               0.9
Primer A                       0.6
Primer B                       0.6
ポリメラーゼ                0.3
DDW                             5.6
Template                         4
Total                          15μL

<TO社製品> 
94℃   2 min
98℃   10 sec  ×5
72℃   45 sec
98℃   10 sec  ×5
70℃   45 sec
98℃   10 sec  ×25
68℃   45 sec
68℃   7 min
4℃    ∞

<TA社製品>         (µL)
×10 PCR Buffer   1.5
×50 dNTP       0.3
Primer A                    0.6
Primer B                   0.6
ポリメラーゼ            0.3
DDW                         7.7
Template                     4
Total                       15μL

<TA社製品>
95℃   30 sec
95℃   5 sec  ×5
72℃   120 sec
95℃    5 sec
70℃   10 sec  ×5
72℃   120 sec
95℃   5 sec
68℃   10 sec  ×25
72℃   120 sec
4℃ ∞

結果

KAPA 社はT 細胞25 個由来cDNA を含む全てのサンプルから増幅できた。
TO 社製品では全く増幅せず、また、TA 社製品では400 個由来cDNA のみ増幅した。

Template  
No1 T細胞400個分のcDNA溶液
No2 T細胞100個分のcDNA溶液
No3 T細胞 25個分のcDNA溶液
No4 Negative Control (T細胞なし)
お客様のコメント
25個のT細胞由来cDNAから増幅できたこと、及び、他社製品に勝つとは驚きました。
サンプルを頂いた甲斐があります、今後は本製品を使っていこうと思います。

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