【お客様事例】マウス肝臓からの「RNA抽出」および「逆転写反応」に用いたキットの性能確認

■ RNA抽出キットと逆転写反応キットの組み合わせ表

qPCRでは、1 sampleごとに3反復を行う。

■ RNA抽出
High Pure RNA Tissue Kit：High Pure RNA Tissue Kit の取扱説明書の推奨プロトコルに準拠した。

FastGene™ RNA Basic Kit ＋ DNase I set：
FastGene™ RNA Basic Kit の取扱説明書（P12 ～）に記載がある『オプション：オンカラムDNaseⅠ 処理（※）』を通常の操作に加えた。
また、Elution Bufferを100 μLとした（通常は50 μL）。

（※）オンカラムDNaseⅠ 処理を加えた洗浄手順（FastGene™ RNA Basic Kit 取扱説明書より抜粋）

S1 メンブレン洗浄1 （タンパク除去と 反応条件の調製）		300μL バッファー RW1 ≥ 10,000 x g（室温：20 ～ 25℃） 30 s カラムを新しいコレクションチューブ（2.0mL）に移す
S2 DNaseⅠ反応 （DNAの分解）		70 μL DNaseⅠ反応溶液（注：メンブレンの中央に添加） インキュベート（室温：20 ～ 25℃） 10 min
S3 メンブレン洗浄2 （分解DNAと 酵素の除去）		300 μL バッファー RW1 ≥ 10,000 x g（室温：20 ～ 25℃） 30 s ろ液廃棄後　カラムを元のコレクションチューブ（2.0 mL）に戻す
S4 メンブレン洗浄3 （塩類の除去）		700 μL of バッファー RW2 ≥ 10,000 x g（室温：20 ～ 25℃） 30 s カラムを新しいコレクションチューブ（2.0 mL）に移す

■ RNA測定機器
吸光度測定機器：Nano Drop™

■ 逆転写反応
すべてのキットでそれぞれの取扱説明書の推奨プロトコルに準拠した。

■ qPCR プログラム

qPCR装置：LightCycler® 96 System Preincubation ：95℃ 600 s 　↓
95℃ 15 s 　↓ 60℃ 60 s		45 cycles
↓ Melting ：95℃ 1 s → 57℃ 15 s → 98℃ 1 s 　↓ Cooling 40℃ 30s

● RNA収量と純度の結果（吸光度測定 – ナノドロップ）