日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？
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下記データは、食肉加工会社のお客様のご厚意により掲載させていただきました。
背景
カンピロバクター食中毒は、わが国で発生している細菌性食中毒の中で、近年、発生件数が最も多く、年間およそ300件、2,000人程度の患者が報告されている。そのため、こちらの食肉加工会社では、定期的にカンピロバクターの検査を実施している。
カンピロバクターの検出方法は、通常培養法で行われるが、判定結果が出るまでおよそ１週間から10日かかる。
一方PCR法を用いれば、約20分という速さで判定結果を得ることが可能である。
目的
モバイルリアルタイムPCR装置を用いた、カンピロバクターの迅速検出法の正確性を、従来の培養法と比較する。
試験方法
通常の検査では、生肉サンプルを用いて行うが、今回はカンピロバクター汚染率の極めて高い鳥盲腸便を用いて、PCR法および培養法で検査を行った。
サンプル採取について
内臓一式（食道から総排泄口まで）を採材した。盲腸の先端を火炎滅菌した後に、滅菌したはさみで先端を切り落とし、切り落とした部分から盲腸便をシャーレに取り出した。
取り出した盲腸便をPBSで1,000倍希釈し、これをPCR法、培養法の各試験の検体とした。
PCR法
使用機器 ：モバイル型リアルタイムPCR装置（PicoGene® PCR1100）
試薬：カンピロバクター属菌検出用キット（準備中）、日本板硝子
（1日目）
検体5 μLを、カンピロバクター属菌検出用キットのチューブに添加
（キットには、試験に必要な酵素、プライマー、プローブなどが混合されている）
↓
検体を入れたキットのチューブから、ピペットで混合液を18 μL吸い取り、
測定用チップへ注入
↓
測定用チップをPCR1100 にセットし、測定を実施
＜PCR測定条件＞
※試薬調製に約5分、判定結果が出るまで約20分
培養法
（1日目）
前培養：プレストン培地 42℃ 24時間 微好気培養
↓
（2日目）
選択増菌培地：バツラー寒天培地 42℃ 48時間 微好気培養
↓
（4日目）
典型的なコロニーを検鏡し、らせん状桿菌をカンピロバクター推定陽性とする
純培養：血液寒天培地 42℃ 48時間 微好気培養
↓
（6日目以降）
確認試験：
① オキシダーゼ試験、② カタラーゼ試験、③ 好気培養、
④ 25℃発育試験、⑤ 馬尿酸塩加水分解試験を実施
①（＋）、②（＋）、③（－）、④（－）でカンピロバクター陽性
⑤（＋）で、C.jejuni、（－）で、C.Coli と型判別を実施
※判定結果が出るまで約1週間
結果
5 検体の検査結果（PCR法と培養法）
| PCR法 | 培養法 | |
|---|---|---|
| 検体① | ＋ | ＋ |
| 検体② | ＋ | ＋ |
| 検体③ | ＋ | ＋ |
| 検体④ | ＋ | ＋ |
| 検体⑤ | ＋ | ＋ |
PCR法
Ct値：32.0
陽性と判定
培養法
プレストン培地で培養後、バツラー選択増菌培地で培養
コロニーの検出および4つの確認試験の結果で、陽性と判断
• 今回の試験では、PCR法と培養法で同様の結果が得られた（全5 検体）。
• 今後も継続的な検討を行い、PCR法と従来の培養法とで同様の結果が得られるか検討が必要
資料：モバイルリアルタイムPCR装置を用いたカンピロバクターの迅速検出
生肉サンプルの場合
● 用意するもの
機器：
モバイル型リアルタイムPCR装置（PicoGene®PCR1100）
測定用チップ MCP1100
試薬：
カンピロバクター属菌検出用キット（準備中）、日本板硝子
その他：
解析用PC（WINDOWS OS）
ストマッカー一式
生肉を小片化するハサミ、またはナイフ、生理食塩水、ピペット、チップ（すべて滅菌済み）
サンプルの前処理
生肉サンプル（25 g）を小片に刻む
↓
小片化したサンプル（25 g）を、滅菌生理食塩水（225 mL）に入れ、ストマッカーで処理を行う
↓
ストマッカー処理液から5 μLをピペットで吸い出し、測定用サンプルとする
＊サンプル採取の際に、固形物を吸わないように注意
盲腸便の場合
● 用意するもの
機器：
モバイル型リアルタイムPCR装置（PicoGene®PCR1100）
測定用チップ MCP1100
試薬：
カンピロバクター属菌検出用キット（準備中）、日本板硝子
その他：
解析用PC（WINDOWS OS）
はさみ、シャーレ、ピペット、チップ、PBS（すべて滅菌済み）
サンプルの前処理
内臓一式（食道から総排泄口まで）を採材
↓
盲腸の先端を火炎滅菌した後に、滅菌したはさみで先端を切り落とし、切り落とした部分から盲腸便をシャーレに取り出す
↓
取り出した盲腸便をPBSで1,000倍希釈し、5 μLをピペットで吸い出し、測定用サンプルとする
測定サンプルの調製
検体5 μLを、カンピロバクター属菌検出用キットのチューブに添加
（キットには、試験に必要な酵素、プライマー、プローブなどが混合されている）
↓
検体を入れたキットのチューブから、ピペットで混合液を18 μL吸い取り、測定用チップへ注入
PCR1100の測定
測定用チップをPCR1100 にセットし、プログラムを選び測定を実施
＜PCR測定条件＞
↓
測定画面に「測定結果」が表示されたら完了
（注意）PCR1100 にて送液エラーが出た場合
測定サンプルを5倍希釈し、再度実施
※5倍希釈方法：5 μLのサンプルに、水（PCRグレード）を20 μL加える
この記事で紹介した製品
- こちらのアプリケーションノートのPDFダウンロード ： こちら
- 製品情報詳細ページ： モバイル リアルタイムPCR装置 PicoGene® PCR1100
- アプリケーションノート検索ページ（型番・キーワード・アプリケーションから検索可能）
今回試験した盲腸便の検体では、濁りがあり100倍希釈まではエラーが出て測定ができませんでしたが、1,000倍希釈する事で測定が可能になりました。
検出感度が良いので、検体を1,000倍希釈しても培養法と同様に陽性判定を確認できました。1,000倍希釈した検体5 μLの中にどのくらいの菌数がいて検出できたかは、今回の試験では分かりませんでしたが、検出に必要な菌数が分かれば、今後の色々な試験の参考になると感じました。