【お客様事例】モバイルリアルタイムPCR装置を用いたエビの急性肝膵臓壊死症（AHPND）の迅速検出

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アプリケーションノート　2021＜01＞
製品名：モバイルリアルタイムPCR装置 PicoGene®PCR1100（Cat.No. PCR1100）
メーカー名：日本板硝子株式会社

下記のデータは、株式会社TBA研究開発川瀬研究室分室小寺拓也様のご厚意により掲載させていただきました。

背景

エビの急性肝膵臓壊死症（Acute hepatopancreatic necrosis disease : AHPND）は特殊な毒素タンパク質を産生するビブリオ属細菌が原因で発生する疾病で、死亡率が非常に高いことが特徴である。
この疾病が原因で、海外のエビ類養殖生産国では生産量が半減し、世界的にエビ類の価格が高騰した。^※１
日本における蔓延を防止するため、水産資源保護法や持続的養殖生産確保法で防疫の対象である「特定疾病」及び水産資源保護法の輸入防疫対象疾病に指定され、PCRでの診断法が確立されているが、今回現場での迅速診断を目的としてモバイルリアルタイムPCR装置を使用して系の確立を目指した。

※１水産防疫の対象疾病
https://www.maff.go.jp/j/syouan/suisan/suisan_yobo/attach/pdf/index-3.pdf

目的

モバイルリアルタイムPCR装置とKAPA3G Plant PCR Kitを用いて、検出限界である40 copies/assayを目標としてAHPND感染エビの迅速検出法を確立する。

検証方法

ターゲット：AHPNDを引き起こすエビ病原菌Vibrio parahaemolyticus
使用した検体：
1）感染エビ抽出サンプル／ DNeasy® Blood & Tissue Kits（Qiagen社）使用
2）Vibrio培養菌コロニー／水懸濁加熱処理
3）感染エビ抽出サンプル／ GenCheck® DNA Extraction Reagent（FASMAC社）使用
使用した試薬： KAPA3G Plant PCR Kit（日本ジェネティクス株式会社）
使用装置：モバイル型リアルタイムPCR装置 PicoGene® PCR1100（日本板硝子株式会社）

● 使用したプライマーとプローブ
（国際獣疫事務局（World Organization for Animal Health：OIE）登録済）
TUMSAT-Vp3_Fw 5’-GTGTTGCATAATTTTGTGCA-3’
TUMSAT-Vp3_Rv 5’-TTGTACAGAAACCACGACTA-3’
VpPirA Probe 5’-FAM-AGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGA-TAMRA-3’

● 反応組成

● 反応プログラム

結果

緑: 1）感染エビQiagen抽出サンプル
青: 2）Vibrioコロニー加熱処理サンプル
橙: 3）感染エビ GenCheck抽出サンプル
黒: ポジコンplasmid 4×10^4 copies, 40 copies, 4 copies

検体	Ct
1）感染エビQiagen抽出サンプル	32.9
2）Vibrioコロニー加熱処理サンプル	20.9
3）感染エビ GenCheck抽出サンプル	24.2
4）ポジコンplasmid 4×10^4 copies	31.4
5）ポジコンplasmid 40 copies	43.9