PMS2遺伝子(遺伝性大腸がん原因遺伝子のひとつ)を標的とした ATリッチ領域を含む長鎖アンプリコンの効果的なシーケンス

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アプリケーションノート 2015<10>
製品名:KAPA Library Amplification Kit(KK2611, KK2612)
メーカー名:KAPA BIOSYSTEMS 社

以下のアプリケーションデータは埼玉県立がんセンター 腫瘍診断・予防科
山本 剛 様、 角田 美穂 様、 部長 赤木 究 様のご厚意により掲載させていただきました。

実験方法

遺伝性大腸がん原因遺伝子のひとつPMS2遺伝子をターゲットとした長鎖アンプリコンのシーケンスでは、特にATリッチ領域におけるライブラリー増幅バイアスによりリード数が減少し、カバレッジが低くなることが問題となっていた。
今回、現行法である「長鎖アンプリコンからNextera XTで作成したTagmentation後のライブラリー」において、KAPA Library Amplification Kit(KAPA HiFi HotStart ReadyMix)を用いてライブラリーを増幅することで、この問題点の改善を試みた。

ワークフロー



※KAPA Library Amplification Kitによるライブラリー増幅

① Tagmentationの中和ステップ後、25μlの反応液に2倍量(50μl)の AMPureXPを添加し、クリーンナップを実施(80%エタノール洗浄×2回)

② 15μl の10mM Tris-HCl, pH 8 あるいは PCR-grade water で溶出

③ 以下の条件でライブラリー増幅を実施

■反応組成
2×KAPA HiFi HS ReadyMix 25μL
Index 1 primer       5μL
Index 2 primer       5μL
Library DNA          15μL
                                     50μL RXN

■PCR サイクル
initial Extension      72℃      3min
Denaturation           98℃     30sec
Denaturation           98℃     10sec
Annealing                63℃     30sec         ×14cycles
Extension                72℃      3min
Hold                        10℃

<現行法>

PMS2遺伝子を標的とした長鎖アンプリコンシーケンスの結果
ATリッチ領域(例えば矢印の領域)などではリードが減少し、カバレッジの低下が見られる。

結果

KAPA Library Amplification(LA)Kitを用いてライブラリー増幅を行った結果、ATリッチ領域でのカバレッジの改善が見られ、より平均的なカバレッジを得ることができた。

他のサンプル(下段サンプルB)でも同様に、KAPA LA Kitを用いてライブラリー増幅した結果、カバレッジの改善が見られた。

お客様のコメント
KAPA Library Amplification Kit(KAPA HiFi HotStart ReadyMix)を用いてATリッチな配列の増幅を行った所、かなりの結果改善が見られました。

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