【お客様事例】KAPA HyperPure Beadsを使用した ライブラリー精製法でのナノポアシーケンスの評価試験

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アプリケーションノート 2022<09>
製品名:
KAPA HyperPure Beads(Cat.No. KK8007)
Short Read Eliminator Kit(Cat.No. 102-208-200(旧Cat.No. SS-100-101-01))
メーカー名:
KAPA BIOSYSTEMS
Pacific Biosciences

下記のデータは、信州大学 繊維学部 応用生物科学科 田口 悟朗 様のご厚意により掲載させていただきました。

背景

Oxford Nanopore Technologies社のMinIONを使用したシーケンスはUSBでPCにつながる小型シーケンサーとして関心が高く、ロングリードのシーケンスが取得できる装置として注目を集めている。
ロングリードのライブラリーを作成する際、ライブラリーをせん断する事なく精製を行う工程も非常に重要となるが、ナノポア社のライブラリー調製キットには精製時に使用するビーズは含まれておらず、専用のプロトコールでは別途他社のビーズを使用する事が推奨されている。
本アプリケーションノートでは、ビーズ精製の操作工程を変える事なく精製用のビーズをKAPA HyperPure Beadsに置き換えても使用できるか、また、作成したライブラリーで得られたシーケンスに問題がないか検証を行った。

評価方法

APN2022<09>評価方法

実験方法

• 初発サンプル 植物Aの組織由来サンプル(0.14 g)
• DNA抽出方法 NucleoBond HMW DNA Kit(Macherey-Nagel社)を使用して精製したゲノムDNA
※植物材料の状態の問題で断片化が進んでいたが、サイズセレクションをして使用した。
• サイズセレクション SREで短いフラグメントをカット
使用したKit:Short Read Eliminator Kit(Cat.No. 102-208-200)(Pacific Biosciences)
• サンプルの確認 電気泳動で短いフラグメントが除去されたことを確認した。その後、NanoDropで濃度を測定
• ライブラリー調製Kit 1D Ligation Sequencing Kit(SQK-LSK110)(Oxford Nanopore Technologies)
• 使用したサンプル数 1サンプル

ライブラリー調製ワークフロー

ライブラリー調製に使用したインプット量:1 μgライブラリー調製ワークフロー

結果

DNA抽出結果
植物Aから抽出したゲノムDNAは、アガロース電気泳動で、若干断片化が進んでいることが確認された(レーン①)が、もとのサンプルの状態に起因すると判断して、SREによるサイズセレクションを行った。
その結果、短いフラグメントの大部分が除去され、10 Kbp以上である事が確認された。(レーン②)。
0.7%アガロースゲル電気泳動によるサイズセレクション結果の確認DNA抽出結果
ライブラリー調製結果
サイズセレクションしたゲノムDNA 1 μgを用いてライブラリー調製を行ったところ、右記の濃度となった(Total 15 μL)。このライブラリー全量をMinIONのフローセルに添加し、24時間のrunを行った。
濃度測定結果(Nano-dropにより測定)

濃度 ライブラリー量
37.9 ng/μL 15 μL
Nanopore Sequenceの結果

24時間のrunで推定8.23 Gbのシーケンスが得られ、リード数は920 k、推定のN50は19.73 Kbpであった。
Run summaryRun summary

まとめ
抽出したゲノムDNAの状態(長さ)から考慮すると、元のサンプルの断片化が若干進んでいたため短かいリード長も多くなったが、10 Kbp以上のロングリードのデータが十分量得る事ができた。
お客様のコメント
Nanoporeのライブラリ調製には、そのまま使用できるので便利でした。
DNAの濃縮も試してみましたが、想定どおりの収率でDNAを回収できました。
操作も簡便なので、特に貴重なDNAサンプルの回収で効果を発揮すると思います。

補足

ビーズ精製① KAPA HyperPure Beadsを使用した精製Protocolビーズ精製① KAPA HyperPure Beadsを使用した精製Protocol

ビーズ精製② KAPA HyperPure Beadsを使用した精製Protocolビーズ精製② KAPA HyperPure Beadsを使用した精製Protocol

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