【お客様事例】MPCポリマーコーティングを用いた限外ろ過回収チューブのタンパク質低吸着性化

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下記データは、国内のお客様のご厚意により掲載させていただきました。

背景

これまで、チューブタイプの限外ろ過膜を用いてタンパク質の精製を行うために、BSA（目的のタンパク質と同程度のサイズ）を用いて予備テストを行ってきました。
そこで、限外ろ過膜通過後にろ過液内にあるはずのBSAが専用の回収チューブに吸着し、回収率が落ちてしまうという問題に直面しました。

回収チューブをかなり強くボルテックスすることで吸着したBSAを回収できたのですが、ボルテックスによるタンパク質へのダメージを考え、吸着抑制コーティングによる対処が最善の選択だと思われました。しかしながら、数回で止めるかもしれない予備実験のために、既製品の高価なタンパク質の吸着抑制用コーティングチューブの購入は難しい状況でした。

そこで、以前エクソソームの回収を行っていた際に知った、エクソソーム吸着抑制に用いられるFastGene™ NovyCoat が、低濃度のタンパク質回収する際にも応用できないかと考え＊、今回、試しに限外ろ過の回収チューブにコーティングを実施してみました。
なお、本アプリケーションノートで用いた0.08 mg/mLは、事前にBSAが限外ろ過膜を効率よく透過できる最適濃度を検討し、決定した最適濃度で行いました。

＊ NovyCoat の主成分MPCポリマーはタンパク吸着を抑制するという報告があります（Ishihara et al., 1998, J BIOMED MATER RES）。

方法

● コーティング
　チューブタイプ限外ろ過後の回収チューブ：Amicon Ultra 100 K（UFC510024）にNovyCoat 0.5 mL 加え、パラフィルムで蓋をし封入。
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　ボルテックスミキサーで撹拌し、コーティングしたい高さまでNovyCoat が上昇するよう回転数を調整した。
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　その状態で約5 秒攪拌を続け、一旦攪拌を中止した。
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　再び約5 秒間攪拌した。
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　NovyCoat を全量廃棄した。
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　NovyCoat を廃棄後、容器を上下逆さにした状態で、チューブラックに一晩静置して乾燥させた。

● タンパク質回収
　BSA水溶液（0.08 mg/mL, 溶媒：超純水）300 μLを限外ろ過膜に与え遠心した。
　遠心条件：14,000 x g, 4℃
　遠心時間：① 5 min、② 10 min、③ 20 min、④ 30 min
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　回収したろ液をA280 OD測定（Nano Drop）で測定し、タンパク質濃度を定量した。
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　遠心前のBSA濃度と、遠心後に回収されたBSA濃度を比較した。

結果

結論
NovyCoat の使用により、限外ろ過後のBSAタンパクの回収率を上げることができた。

 

NavyCoatによって、BSAのチューブへの吸着を大幅に抑えることができました。回収タンパク質の酵素活性を見ることが目的の実験のプレ実験でしたが、回収のためにボルテックスやピペッティングなどのタンパク質に影響を与えるような操作を試みる必要がなく、酵素活性へのダメージを極力抑えることができそうです。また、自分が使いたいチューブに簡単に低吸着コーティングができて、使い勝手がよかったです。今回はプレ実験だったので、数回で止めるかもしれない実験のために既製品の高いコーティングチューブを購入するのは少し抵抗がありました。NovyCoatを使うとチューブを追加購入する必要がなく、使う分だけコーティングチューブが作れたので助かりました。チュー類をいろいろ変えて検討したい時にも使えるのではないかと思います。

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