【お客様事例】ダイズから抽出したRNAを用いたイソフラボン生合成関連酵素の遺伝子クローニング

逆転写酵素

逆転写酵素：
FastGene™ Scriptase Ⅱ
cDNA Synthesis Kit

■特徴
・より長いcDNAを得るための低活性RNase
・qPCRやNGSなどのために
最適化された組み換え組織

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PCR反応

PCR酵素：
KOD FX Neo（TOYOBO)
PCR装置：
PCR Thermal Cycler Dice
（TaKaRa）

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クローニング
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電気泳動

ゲル撮影装置：
TF-20L（Vilber Lourmat）
核酸染色試薬：
エチジウムブロマイド

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シーケンス

5x FastGene™ Scriptase Ⅱ buffer　4 μL
0.1 M DTT　　　　　　　　　　　  2 μL
RNase Inhibitor　　　　　　　　　 0.5 μL

6）42℃で 2 分間インキュベートした（プライマーのアニーリング）
7）氷上にてRNA混合液にFastGene™ Scriptase Ⅱを1μL添加した
8）42℃で50分間インキュベートした（逆転写酵素活性化）
9）70℃で15分間インキュベートした（逆転写酵素不活化）

10）合成したcDNAをPCR増幅した

●反応組織
SDW　　　　　　　　　　　　  10 μL
2x PCR Buffer for KOD FX Neo　25 μL
2 mM dNTPs　　　　　　　　　10 μL
プライマー（10μM each）　　　1.5 μL
テンプレート（合成したcDNA）  1  μL
KOD FX Neo（1U / μL）　　　　1  μL
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Total　　　　　　　　　　　　　50 μL

●PCRプログラム
94℃　　　　2 min（初期変性）
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98℃　　　　10 sec（変性）
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55℃　　　　30 sec（アニーリング）　　30 cycles
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68℃　　　　1 min（伸長反応）

●電気泳動条件
100V.　20 min
2 %　アガロースゲル
1×TAE Buffer

14）シーケンスで配列確認をした