【お客様事例】FastGene Gel/PCR エクストラクションキットを利用したマウス糞便中の腸内細菌解析

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アプリケーションノート　2021＜14＞
製品名：Gel/PCR エクストラクションキット（Cat.No.FG-94602、FG-91202、FG-91302）
メーカー名：FastGene™

下記のデータは、岐阜大学大学院自然科学技術研究科溝口桃加様、竹森洋様より情報をご提供いただきました。

概要

糞便サンプルからDNA抽出を行う場合、糞便中に含まれる様々な菌からDNAを回収できることが重要です。特に細胞壁を有する微生物には、菌体を破砕する方法が非常に重要であるため、各社至適化された専用の試薬キットやガラスビーズ等を用いて処理が行われます。
本アプリケーションノートでは、専用の試薬キットとは異なるFastGeneエクストラクションキットを用いることで、WTマウス（C57BL/6J）と炎症性腸疾患マウス（C57BL/6J ^Ru2/Ru2下痢発症）¹の糞便から、安価で簡便にDNAを精製することができた事例となります。
精製できたDNAを用いて、腸内細菌に含まれるFirmicutesの量について検証を行いました。

方法

①DNA精製

サンプル
WT	：	ワイルドタイプマウス C57BL/6J（日本エスエルシー株式会社）
diarrhea	：	炎症性腸疾患マウス　C57BL/6J^Ru2/Ru2（岐阜大学）上記２種のマウスの新鮮便（Fresh）と、回収して1時間後の糞便（Not Fresh）の2種類を用いた
試薬	：	FastGene Gel/PCR エクストラクションキット（FastGene）

②PCR：腸内細菌FirmicutesファミリーのリボゾームRNA遺伝子を増幅

試薬： Expand High Fidelity PCR System
（Roche,Cat.No.11732641001/11732650001/11759078001）

反応液組成

Template DNA（30 ng/μL）	1.0 μL
Expand High Fidelity Enzyme mix	0.2 μL
Expand High Fidelity Buffer（10×）with 15 mM MgCl₂	2.5 μL
Primer-F（10 pmol/μL）	0.5 μL
Primer-R（10 pmol/μL）	0.5 μL
dNTP mix（2 mM）	2.5 μL
DW	17.8 μL
Total	25.0 μL

PCR条件
使用プライマー ²
増幅サイズ：126 bp
Primer-F：（Firm934F）,GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA
Primer-R：（Firm1060R）,AGCTGACGACAACCATGCAC

結果

①各サンプルのDNA収量と精製度

	使用糞便量	DNA収量	A260値	A280値	A260 /A280
Fresh （WT）	約100 mg	8.509 μg	1.702	1.146	1.48
Fresh （diarrhea）	約100 mg	2.886 μg	0.577	0.406	1.42
Not Fresh （WT）	約50 mg	14.330 μg	2.866	2.059	1.39
Not Fresh （diarrhea）	約50 mg	7.016 μg	1.403	0.977	1.44

②等量の精製したDNA中に含まれるFirmicutesの量

まとめ

Gel/PCR エクストラクションキットを用いて、糞便からDNA精製を行い、腸内細菌に含まれるFirmicutesの量について検証することができた。
炎症性腸疾患マウスでは、細菌叢の変化により、 Firmicutesの割合が低いことが示唆された。
新鮮便と一定時間が経過した糞便では、新鮮便の方がPCRの増幅効率が高いため、新鮮便を用いて実験するのが望ましい。

参考文献
1：Simple chronic colitis model using hypopigmented mice with a Hermansky-Pudlak syndrome 5 gene mutation. Itoh Y, Nagaoka Y, Katakura Y, Kawahara H, Takemori H.
Pigment Cell Melanoma Res. 2016, 29: 578-582
2：Mouse Model of Metformin-Induced Diarrhea.
Takemori H, Hamamoto A, Isogawa K Ito M, Takagi M, Morino H, MIura T, Oshida K, Shibata T
BMJ Open Diabetes Res Care. 2020, 8:1