【お客様事例】Newcastle disease virus（NDV）感染細胞を用いたRNA-FISHと免疫染色実験

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アプリケーションノート 2015<20>

製品名：μ-slide 8well, ibiTreat：#1.5 polymer coverslip, tissue culture treated,
sterilized（ib80826）
メーカー名：ibidi社

このアプリケーションノートは、京都大学ウイルス研究所分子遺伝学研究分野呉成旭様のご厚意により掲載させていただきました。ここに深く感謝申し上げます。

実験概要

細胞はウイルスに感染すると、インターフェロン（IFN）という抗ウイルス性サイトカインを産生して免疫応答を始動する。本アッセイでは、HeLa 細胞にNewcastle disease virus（NDV）を感染させ、NDVヌクレオキャプシドタンパク質（NP）とI 型IFN（IFN-β）mRNA の発現を免疫染色法とRNA-FISH 法によってそれぞれ検出した。
また、ibidi μ-Slide 8well コーティング ibiTreatを用いて、蛍光検出したサンプルを保存できるかどうか確認するため、およそ半年間室温で遮光保存し、再度観察を行い、RNA-FISHと免疫蛍光染色したサンプルの保存状態を確認した。

<カバーグラスによる封入のイメージ>　 <１ウェルを横から見た図>

実験材料

細胞　　　　　：HeLa細胞（ヒト子宮頸がん由来上皮細胞）
培地　　　　　：DMEM（ナカライテスク #08459-35） + 10% FBS
　　　　　　　　 + 1% ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク #26253-84）
培養容器　　　：ibidi μ-slide 8 well, ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized (ibidi #80826)
FISHキット　：ViewRNA ISH Cell Kit（Affymetrix #QVC0001）
FISHプローブ：interferon, beta 1, fibroblast（Affymetrix #VA4-15818）
抗体：（一次抗体）Anti-NDV-N mouse monoclonal IgG（広島大学坂口先生より供与）
（二次抗体）AlexaFluor 488 Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (Life Technologies#A-21202)
封入剤：Fluoromount-G（SouternBiotech #0100-01）
カバーガラス： MICRO COVER GLASS 9×9（松浪硝子特注）
顕微鏡：レーザー共焦点顕微鏡 TCS-SP8（ライカマイクロシステムズ）
染色後の保存条件：室温・遮光保存
　

アッセイプロトコール

1. HeLa 細胞を2.5×104 cells/well で播種し（培地量は250 μL/well）、NDV を12 時間感染させた。
2. 4% PFA で細胞を固定し、ViewRNA ISH Cell Kit を用いてRNA-FISH を行った（キット添付マニュアル参照）。
3. RNA-FISH 後のサンプルを0.5% BSA/PBS-T でブロッキングし、NDV-NP に対する免疫染色を行った（一次抗体反応：4℃一晩、二次抗体反応：室温1 時間）。
4. DAPI 染色後、細胞を封入し、共焦点顕微鏡にてサンプルを観察した。