日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？
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| アプリケーションノート 2019＜09＞ 製品名：FastGene™ RNA Premium Kit（FG-81050, FG-81250） FastGene™ ScriptaseⅡ Master Mix（5X）（NE-LS64） メーカー名：FastGene™ |
下記データは、京都大学のお客様のご厚意により掲載させていただきました。
概要
FastGene™ RNA Premium kit は細胞から抽出する際に、スタンダードプロトコルで5×106 培養細胞、ラージインプットプロトコルで1×107培養細胞の細胞数から抽出することを推奨したキットである。本アプリケーションノートでは、FastGene™ RNA Premium kitを用いて少数細胞数（1×103 培養細胞）からRNAを抽出するプロトコルを検討し、Q社微量RNA精製キットと比べて同等以上の収量およびCt 値を得られた一例を報告する。
実験条件
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1. RNA精製 RNA回収方法： |
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| （Q社キットの場合、n = 3） 4. Flow throughを捨て、カラムを再装着し、RW1 700 μLを加えてスピンダウン（室温、max、～30 s） 5. Flow throughを捨て、カラムを再装着し、RPE 500 μLを加えてスピンダウン（室温、max、～30 s） 6. Flow throughを捨て、カラムを再装着し、80% EtOH 500 μLを加えてスピンダウン（室温、max、～30 s） 7. 新しい廃液チューブにカラムを装着し、スピンダウン（室温、max、1 min） 8. 新しい1.5 mLチューブにカラムを装着し 、 RNase-free water 20 μLをフィルターへ加え、室温で3 min程度静置 9. 室温、max、1 minで遠心し、Flow throughを回収 （FastGene™ RNA Premium（簡略プロトコル）の場合、n = 3） RNA濃度測定方法: |
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FastGene™ RNA Premium Kit| 2. 逆転写反応 FastGene™ ScriptaseII（ マスターミックス）を用いて行った RNAサンプル6 μLに対して逆転写試薬を1.5 μL 加え、以下の温度サイクルで行った 25℃ 10 min → 42℃ 60 min → 85℃ 5 min → 4℃ hold |
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| 3. リアルタイムqPCR 試薬：THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO） 機器：StepOnePlus（Thermo） （解析対象遺伝子：高発現（high）および中程度発現（medium）） サイクル条件：TOYOBOのThunderbird プロトコル通り |
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検討方法ワークフロー
結果
Qubit4による収量の結果
| 使用キット | Yield |  |
|||
|---|---|---|---|---|---|
| Yield [ng/μL] |
Mean [ng/μL] |
SD | |||
| Q社 | 1 | 5.06 | 8.03 | 3.16 | |
| 2 | 6.62 | ||||
| 3 | 12.4 | ||||
| FastGeneTM | 1 | 25.3 | 23.90 | 2.42 | |
| 2 | 20.5 | ||||
| 3 | 25.9 | ||||
| Qubit4による収量を比較したところ、FastGene™ RNA Premium kitはQ社と比較して約3.0倍の量が得られた。（＊t 検定：P＜0.05） | |||||
qPCR結果1：高発現（high）
| 使用キット | Ct | Mean | Mean Ct | SD | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Q社 | 1 | 6.83 | 6.87 | 6.86 | 0.08 |  |
| 6.92 | ||||||
| 2 | 6.74 | 6.78 | ||||
| 6.83 | ||||||
| 3 | 6.98 | 6.93 | ||||
| 6.87 | ||||||
| FastGeneTM | 1 | 5.38 | 5.36 | 5.47 | 0.22 | |
| 5.34 | ||||||
| 2 | 5.78 | 5.77 | ||||
| 5.77 | ||||||
| 3 | 5.32 | 5.27 | ||||
| 5.23 | ||||||
qPCR結果2：中程度発現（medium）
| 使用キット | Ct | Mean | Mean Ct | SD | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Q社 | 1 | 17.15 | 17.12 | 17.03 | 0.09 |  |
| 17.08 | ||||||
| 2 | 16.90 | 16.91 | ||||
| 16.92 | ||||||
| 3 | 17.07 | 17.05 | ||||
| 17.03 | ||||||
| FastGeneTM | 1 | 15.90 | 15.87 | 16.00 | 0.14 | |
| 15.85 | ||||||
| 2 | 16.20 | 16.19 | ||||
| 16.17 | ||||||
| 3 | 15.96 | 15.94 | ||||
| 15.93 | ||||||
| qPCRによるCt値を比較したところ、高発現（high）、中程度発現（medium）ともにFastGene™ RNA Premium kitはQ社と比較してCt値が小さかった。（＊t 検定：P＜0.05） | ||||||
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- 製品情報詳細ページ： FastGene™ RNA Premium Kit
FastGene™ ScriptaseⅡ Master Mix（5X） - アプリケーションノート検索ページ（型番・キーワード・アプリケーションから検索可能）
通常使用しているサンプルは、RNA濃度が低い一方でタンパクやDNAのコンタミが少ないので、（TRIzolを使用しているため）フィルター含めて3回カラムに通すメリットが無いので、省略しました。
FastGene™のキットはQ社よりも工程が1つ少ない点と、廃液チューブを繰り返し使用しない点から、作業時間も短縮できています。