【お客様事例】大腸菌コロニーダイレクトPCR

日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？

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  アプリケーションノート　2018＜06＞ 製品名：　KAPATaq EXtra HotStart ReadyMix with dye（KK3606） メーカー名：　KAPA BIOSYSTEMS 社

  下記データは、東京医科大学 生化学分野 森谷 昇太 様の御厚意により掲載させていただきました。

  方法

  プラスミドを制限酵素処理し、他プラスミド由来の外来遺伝子を組み込む実験を行いました。
  そこで、目的のインサートを持ったコロニーを選別するためのコロニーダイレクトPCRにKAPATaq EXtra HotStart ReadyMix with dyeを使用しました。

  ● 反応組成
  KAPATaq EXtra HotStart ReadyMix with dye 　10.0 μL
  100μM forward primer　　　　　　　　　　　 0.2 μL
  （ ベクター既存配列内に設計）
  100μM reverse primer 　　　　　　　　　　　0.2 μL
  （インサート配列内に設計）
  超純水　　　　　　　　　　　　　　　　　　 9.6 μL
  ————————————————————————-
  Total 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 20.0 μL

  16.5 本分まとめて作成し、各20μLで16 本分注。
  コロニーを滅菌爪楊枝で採取し、PCR反応液に直に懸濁

  ● PCRプログラム
  95℃　 5 分
  95℃ 　30 秒
  55℃ 　1 分 　35 サイクル
  72℃ 　2 分
  72℃ 　5 分
  16℃ 　hold

  増幅サイズ：約700bp
  サーマルサイクラー：BIO-RAD MyCycler

  結果

  

  レーン3、6、7、15で目的のインサート由来のバンド（約700bp）が確認されました。（画像は16サンプルのうちの15サンプル分の結果を示しています。）

  使用ゲル： 1%TBEアガロースゲル（アガロース：NE-AG02 日本ジェネティクス）
  核酸染色試薬＊： ミドリグリーンアドバンス（NE-MG04 日本ジェネティクス）
  電気条件： 100V 30分、TBE緩衝液
  ゲル撮影： FAS-Digi & Blue/Green LEDイルミネーター（日本ジェネティクス）
  ＊先染めにてアガロースゲル30mlあたりミドリグリーンアドバンス1.5μl添加（1:20,000）

  お客様のコメント

  日常の実験で使用できる安価なDye入りホットスタートタイプのTaqポリメラーゼを探していました。
  ホットスタートタイプのものは高価なため、従来は他社Dye入りのホットスタートではない標準タイプを使用していましたが、プライマーダイマーなどに悩まされてしまうことも多々ありました。
  今回、日本ジェネティクスさんからDye入りで安価なホットスタートタイプのものが発売されたとのことで使用してみました。
  結果、写真のようなクリアな実験結果が得られ、陽性コロニー率が低い実験でしたが、目的の配列を持ったコロニーを簡単に選別することが出来ました。Dye入りのため、多検体での電気泳動にかかる手間も大幅に短縮できました。
  今後も様々な用途に重宝しそうです。

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