【お客様事例】MinIONライブラリ調製におけるBluePippinを用いたサイズセレクション

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アプリケーションノート　2017＜21＞
製品名：自動DNA断片ゲル抽出システム BluePippin（BLU0001）
メーカー名：Sage Science社

下記データは、慶應義塾大学先端生命科学研究所荒川和晴様のご厚意により掲載させていただきました。

背景

一般的に、次世代シーケンスにおいては、現在のところ、短いライブラリのデータが優先的に得られやすい傾向がある。この場合、「サイズセレクション」により目的サイズを分離回収したサンプルを使用してライブラリを作製することが、より効果的に目的のデータを得るための解決策となる。
本アプリケーションノートでは、BluePippinを用いてサイズセレクションを行ったサンプルを用いて作製したライブラリを、MinION（Oxford Nanopore Technologies）でシーケンスを行った結果の一例を紹介する。

実験条件と実験手順

● 生物種
アメリカジョロウグモ（Nephila clavipes）の成体の脚一本

① サンプルDNA抽出
　 Qiagen Genomic-tip 20/Gを用いてDNAを抽出
　（イソプロパノール沈澱後、最終ElutionはBuffer EB（Qiagen）で
　 100 μL）

② Agilent TapeStation Genomic ScreenTapeでサイズ確認
　 InvitrogenTM QubitTM システムでDNA量の確認

③ BluePippinで10 kb以上のDNAサンプルをサイズセレクション
　ゲルカセット：0.75%ゲルカセット Marker S1（BLF7510）
　抽出条件：high-passモード　0.75% DF Marker S1 High-Pass 6-10kb vs3
　 Input DNA量：10 μg/well（30 μL）

④ Agilent TapeStation Genomic ScreenTapeでサイズ確認
　 InvitrogenTM QubitTM システムでDNA量の確認

⑤ ライブラリ作製
　ライブラリ作製キット：ONT Ligation Sequencing Kit 1D（SQK-LSK108）
　 Input DNA量：1 μg（45 μL）
　＊ライブラリ作製時のポイント（プロトコル変更点）＊
　 • fragmentation / repairはスキップして、End prepから
　 • EndPrepのインキュベート、プロトコルの20℃ 5分、65℃ 5分から、→20℃15分、65℃5分に変更
　 • Adapter Ligationの、室温10分のインキュベートを、室温30分に変更　
　 • Adapter LigationのAMPure XP（Beckman-Coulter）の量を、40 μLから45 μLに変更

⑥ Agilent TapeStation Genomic ScreenTapeでサイズ確認

⑦ MinION（Oxford Nanopore Technologies）によるシーケンス解析

結果

② Agilent TapeStation 　 Genomic ScreenTape 　によるサイズ確認　（BluePippin前）
② Agilent TapeStation 　 Genomic ScreenTape 　によるサイズ確認　（BluePippin後）
⑥ Agilent TapeStation 　 Genomic ScreenTape 　によるサイズ確認　（ライブラリ作製後）

⑥ シーケンスの結果
	Read number	1,670,827
	Total read length	7,655,872,327
	Average read length	4,582
	Longest read	566,198
	Shortest read length	5
	N50	8,489（#268112）
	N90	2,034（#956151）

MinION用ライブラリにはDNA末端のポアへの運搬を補助するtetherがついた状況で作成されるため、ライブラリ作成後のサイズセレクションが叶わない（電気泳動でtetherが外れてしまう）。そのためサイズセレクションはライブラリ作成前に行う必要がある。一方、ライブラリ作成時のピペッティングや、複数回行うAMPure XP精製の乾燥ステップでDNAは多少断片化されてしまうため、サイズセレクションを行なったとしてもシーケンスデータでは短いDNAも読まれてしまうが、サイズセレクションを行わないとこれよりも短いリードの割合が増える。