【お客様事例】FastGene™ Plasmid Mini Kitを使用したプラスミドの精製

日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？

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アプリケーションノート 2016<25>

製品名：FastGene™ Plasmid Mini Kit（FG-90402）
メーカー名：日本ジェネティクス株式会社

下記のデータは、山口大学医学部薬理学講座本田健様のご厚意により掲載させていただきました。
FastGene™ Plasmid Mini Kit で抽出したプラスミドを使用して、トランスフェクション（ルシフェラーゼ活性）を試みました。

実験条件

● サンプル
　大腸菌株：TOP10
　ベクター：pGL4 Vector 4.3kb（インサートサイズ 0.5～2kb） ※インサート：プロモーター領域
　キットへの使用量：LB培地 2.5 mL
● 手順
1．プラスミドDNAを形質転換したTOP10をLB培地で培養した
2．培養2.5mLスケールから大腸菌を回収し、FastGene™ Plasmid Mini Kit にてプラスミドDNA を精製した（溶出バッファー50μL）
3．DNA収量を吸光度計（NanoDrop）で測定した（結果①）
4．制限酵素消化し、電気泳動により想定の断片パターンかどうか確認した（結果②）
5．トランスフェクション後、ルシフェラーゼ活性の測定を行った（結果③）
　　検出装置：パーキンエルマー社の2030 ARVO X シリーズ　マルチラベルリーダー

結果

① 得られたDNAと純度

#	溶出バッファー量（μL）	yield（μg）	Nucleic AcidConc.Unit	A260	A280	A260/A280	A260/A230
pGL4-prom-498	50.0	16.3072	332.8ng/μL	6.656	3.511	1.90	2.20
pGL4-prom-998	50.0	14.2541	290.9ng/μL	5.818	3.088	1.88	2.17
pGL4-prom-1489	50.0	16.2092	330.8ng/μL	6.617	3.655	1.81	1.97
pGL4-prom-1994	50.0	23.4465	478.5ng/μL	9.571	5.063	1.89	2.24

②電気泳動
精製プラスミドを制限酵素チェックに用いた条件：
1 レーン10μL (250ng) 使用、TAE バッファー、0.7％TAE アガロース、100V・30 分

数値は想定の塩基長bp
※500bp 以下のバンドはゲル画像では検出されていません。

③ ルシフェラーゼ活性の測定
想定の断片を確認後、マウス筋芽細胞C2C12 細胞に導入し、レポータージーンアッセイを実施した。
Lipofectamine2000にてDNA 0.2μg を 10^5 cellsに導入した。
24h後に刺激を与え、細胞ライセートを回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。

刺激により、全てのプロモーターでルシフェラーゼ活性が促進された。