NGS 関連製品ラインナップ特集【ライブラリー定量 編】

次世代シークエンスに関する製品、受託サービスは弊社にお任せ！

弊社は、NGSアプリケーションに関して、幅広い製品ラインナップおよびサービスをご提供しており、網羅的にサポートすることができます。本シリーズは、各アプリケーションごとに特徴のある製品を一挙ご紹介をさせて頂きます！

今回こちらの記事では【ライブラリー定量 編】と題し、ロット間差を最小限に抑えたバリデーション済みDNA定量スタンダードが希釈済みで添付されている唯一のキット、KAPA Biosystems 社 ライブラリー定量キットをご紹介いたします。

5．ライブラリー定量

KAPA Library Quantification Kit
・信頼性の高い定量化法（qPCR法）により、画期的な効率改善を得られる ・GC、ATリッチでも安定した結果をもたらす ・ロット間差を最小限に抑えたバリデーション済みDNA定量スタンド（希釈済み）が添付

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正確なライブラリーの定量は、最適なクラスター数を得るために必須です！

図1

（図１）qPCRベースのKAPA ライブラリー定量キットはA社泳動解析装置よりも、クラスター密度のバラツキを抑えます。

ヒトエクソームサンプルを、Nimblegen溶液ベースのキャプチャを用いて調製しました。調製はすべて、リキッドハンドリングシステムの96ウェルプレート・フォーマットで実施しました。データは、illumina GAllxでペアエンド76 bpを解析したときの1タイルあたりのクラスター数です。
（こちらのデータは、ワシントン大学のご厚意で掲載させて頂きました）

図2

（図２）分光光度測定法、蛍光分析法および電気泳動法と比べ、qPCRはアダプター結合したライブラリー分子および増幅可能なライブラリー分子だけを定量します。

アダプター（オレンジとブルー）がライブラリーDNA分子（グレー）の両端へ結合しますが、図のようにアダプターが結合しない分子が混合した状態になります。
しかし、次世代シークエンスでは、最適なクラスター密度やテンプレート：ビーズ比は「PCR増幅可能なDNA分子」の濃度に依存します。
泳動解析や分光光度測定法で濃度測定した場合、これら混合した分子全ての濃度を測定してしまいますが、一方、両端にアダプターを持つライブラリーのみを測定するqPCRベースのライブラリー定量法では、最適なライブラリー濃度を得ることができます

図3

（図３）Roche Titaniumシリーズ・プラットフォーム向け
KAPA Quantification Kitのロット間差

各定量スタンダードセットの増幅プロットを分析し、3つの異なるロット（レッド、ピンク、ブルー）を比較した。各データ点の3反復を平均化した。

図4

（図４）ロット間差、キット間での最小の変動性

9つのヒトDNAライブラリーと2つの微生物DNAライブラリーを用い、定量結果の比較をした。異なるロット（Lot 1とLot 2）と、ilumina GAプラットフォーム向けKAPA Library Quantification Kitの同一ロットから得た異なる試薬のセット（set 1とset 2）を用いた。