FFPE検体からのNGSワークフロー～標本からアッセイまで～

FFPE検体からのNGSワークフローにおける根本的課題

ホルマリン固定パラフィン包埋（formalin-fixed paraffin-embedded : FFPE）組織は、がんゲノム研究や臨床検査において非常に重要な検体です。しかしながら、FFPE検体から抽出される核酸はホルマリン固定工程により断片化されており、また、NGS解析においては脱アミノ化によるダメージでエラー率が高いことが課題となります。ロシュでは品質にばらつきがあるFFPEからの検体を、サクセスレート良く、かつ、煩雑な手順なしに短時間で処理するためのトータルソリューションを開発しています。

FFPE検体からのNGS解析ワークフロー

FFPE検体からのNGS解析ワークフローは、ダイセクション、核酸抽出、ライブラリ調製、シークエンシング、レポーティングの工程に分類されます。ロシュでは検体からレポートまでの様々なFFPEソリューションを持っており、これらのポートフォリオを組み合わせることで実験目的に合わせたFFPEワークフローの最適化が可能になります。

ダイセクション

アベニオ Millisectは新しいタイプのティシューダイセクション装置で、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織上の目的領域（腫瘍領域）を物理的に削り取り、回収することで、検体の腫瘍含有率を向上させます。

特長

物理的な削り取りにより、熱によるダメージを受けない
チップ内部に吸引することで検体の損失を低減
画面上での連続切片間の位置合わせで1度に最大4枚までのスライドを処理
作業ミスや作業者によるばらつきの低減、標準化
マニュアルダイセクションと比較して同等またはそれ以上の核酸収量

リファレンス
1.Geiersbach K et al. Cancer Genet. 2016;209(1-2):42-49.
2.Javey M et al. J Mol Diagn. 2021;23(4):399-406.
3.アベニオ Millisect White Paper: マニュアルダイセクションと比較して核酸・タンパク質の収量が向上 (MC-JP-06247)

Cat.No	製品名	単位
518-219468	アベニオ Millisect	一式
518-219291	アベニオ Millisect チップS （黄）	48本
518-219307	アベニオ Millisect チップM （緑）	48本
518-219314	アベニオ Millisect チップL （青）	48本
518-219321	アベニオ Millisect フィルステーション	16個

医療機器製造販売届出番号：13B1X00201000075

※こちらの製品は、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社から販売させていただいております。
本製品に関するお問い合わせは、下部にある「質問フォーム」からお送りください。折り返し、ロシュ社の担当者よりご連絡させていただきます。

核酸抽出

オートメーション

MagNA Pure 24／MagNA Pure 96は様々な検体からのバッチ処理が可能な自動核酸抽出装置です。FFPE検体からの核酸抽出には、機内で脱パラフィンを行うことのできる試薬との併用が便利です。

特長

様々な検体種から抽出が可能
脱パラまで機内で行える、“本当に全自動”のFFPET用試薬
キシレン等の有機溶剤不使用
液面検知でエラー低減

Cat.No	製品名	単位
07290519001	マグナピュア 24 インスツルメント	一式
518-499969	MagNA Pure FFPET Buffer Set	最大48回
518-218522	MagNA Pure 24 Total NA Isolation Kit	最大96回

医療機器製造販売届出番号：13B1X00201000073

※その他に必要な消耗品や試薬がございます。詳しくはお問い合わせください。

マニュアルプレップ

High Pureシリーズはフィルターカートリッジ式のマニュアルプレップの核酸精製キットです。一方、 KAPA Express Extract Kitは検体と混合して加熱振盪するだけで核酸の抽出を行う試薬で、反応後にKAPA HyperPure BeadsまたはKAPA Pure Beadsで精製することで、様々なアプリケーションに使用いただくことができる核酸が得られます。

特長（KAPA Express Extract Kit）

キシレン等の有機溶剤不使用
全体の所要時間2時間で、操作が非常に簡単

Cat.No	製品名	単位
07961600001 (KK7101)	KAPA Express Extract Kit	100反応
06650767001	High Pure FFPET DNA Isolation Kit	50回
06650775001	High Pure FFPET RNA Isolation Kit	50回

※その他の包装サイズなど、詳しくはお問い合わせください。

NGSライブラリ調製

DNAからのライブラリ調製

KAPA HyperPrep／HyperPlusシリーズは、ワンチューブで反応を進めることが可能なIllumina社シークエンサー用のライブラリプレップキットです。FFPEからの場合、品質に応じて50 ng以上のDNAをライブラリ調製に使用していただくことが推奨されます。 MagNA Pure 24／MagNA Pure 96で抽出したサンプルを用いる場合のテクニカルノートもご参照ください

特長

断片化酵素あり(HyperPlus)と無し(Hyper Prep)から選択可能
断片化酵素による反応を含め約2.5時間でライブラリ調製完了
自動化に最適

Cat.No	製品名	単位	取り扱い
0796240101 (KK8512)	KAPA HyperPlus Kit	24反応
07962347001 (KK8502)	KAPA HyperPrep Kit	24反応

※その他の包装サイズなど、詳しくはお問い合わせください。

RNAからのライブラリ調製

KAPA RNA Hyperシリーズは、DNA用のライブラリ調製キットで培われたHyperケミストリをRNAに応用したキットとなります。精製用のビーズなどがセットになった使いやすい構成です。rRNA除去用試薬が付属したキットもご利用いただけます。

特長

KAPA RNA HyperPrep Kit：1-100 ngのtotal RNAからストランド特異的なライブラリを約4時間で調製
KAPA mRNA HyperPrep Kit：50 ng-1 μgのtotal RNAからストランド特異的なライブラリを調製。mRNAキャプチャービーズが付属しています。

Cat.No	製品名	単位	取り扱い
0809809370 (KK8540)	KAPA RNA HyperPrep Kit	24反応
0809811570 (KK8580)	KAPA RNA mRNA HyperPrep キット	24反応

※その他の包装サイズなど、詳しくはお問い合わせください。

ライブラリ調製用アクセサリキット：ビーズキット

核酸精製用ビーズとして、KAPA HyperPure BeadsとKAPA Pure Beadsの2種類をラインナップしています。KAPA Pure BeadsはPEG/NaCl solutionを用いる「with-bead」プロトコルで、KAPA HyperPure BeadsはゲノムDNA精製を含むそれ以外の精製に使用します。

Cat.No	製品名	単位	取り扱い
8963835001 （KK8007）	KAPA HyperPure Beads	5 mL
7983271001 (KK8000)	KAPA Pure Beads	5 mL

※その他の包装サイズもございます。詳しくはお問い合わせください。

ライブラリ調製用アクセサリキット ：アダプターキット

Illumina社シークエンサーを使う場合のアダプターは近年インデックスホッピング対応としてユニークデュアルインデックスが主流となっています。PCRによるバーコーディングのためのユニバーサルアダプターとそのプライマー、 Full Lengthのアダプターの2種類をラインナップしています。

Cat.No	製品名	単位
09063781001	KAPA Universal Adapter	96反応
09134336001	KAPA UDI PrimerMixes	1 x 96ウェルプレート
08861919702 (KK8727)	KAPA Unique Dual-Indexed Adapter Kit	1 x 96ウェルプレート

NGS用エンリッチメント試薬

ターゲットエンリッチメントキットはSeqCapからKAPA HyperCaptureシリーズにリニューアルされました。長年培われてきたプローブデザインアルゴリズムと、最適化された最新プロトコールとの組み合わせで、優れたパフォーマンスが得られます。ターゲット遺伝子をカスタマイズすることも可能です。

特長

均一なシークエンシングdepth
重複リードの抑制
短時間のハンズオンタイムの合理化されたワークフロー
最大16サンプルまでのマルチプレックスに対応

ヒトエクソーム解析：Hyper Exome

RefSeq、CCDS、Ensembl、GENCODE、ClinVarから設計したコンパクトデザイン（ターゲットサイズ43 Mb）
サンプルトラッキングのための387 SNPをカバー

ヒトカスタムパネル解析：HyperChoice

ターゲットサイズに応じて製品を選択可能（0.5 Mbまで、3 Mbまで、5 Mbまでなど）
専用デザインツール「HyperDesign (www.hyperdesign.com)」で簡単プローブ設計

Cat.No	製品名	単位
09062548001	KAPA HyperExome	12反応
various	KAPA HyperChoice MAX 0.5Mb	12反応
various	KAPA HyperChoice MAX 3Mb	12反応
various	KAPA HyperChoice MAX 5Mb	12反応

※様々な包装サイズがあり、上記のプローブ以外の試薬が必要です。詳しくはお問い合わせください。

がんNGSアッセイシステム

AVENIO Oncology Assayは、核酸抽出から解析対象のがん遺伝子領域をエンリッチするための試薬キットと、専用の解析機器とで構成されるアッセイシステムです。FFPE検体用と血漿用の両方をラインナップしており、それぞれで最適化された試薬及び解析アルゴリズムを使用して解析します。例えば、1人の患者さんの手術時の検体（FFPE検体）と手術後の血漿を一つのアッセイシステムで解析することなどが可能です。

特長

キシレンを使わず、非カラム法で核酸を抽出するキットを同梱
品質に応じたインプットDNA量の調製で、高いアッセイ成功率
C>Tエラーを抑制するDNAポリッシュ処理を含む試薬
プロファイリングまたはモニタリング用からパネルを選択可能
血漿アッセイと相互に使い分けが可能

Cat.No	製品名	単位
518-114503	AVENIO Tumor Tissue Targeted Kit (Plate A)	24テスト
518-114510	AVENIO Tumor Tissue Targeted Kit (Plate B)	24テスト
518-114527	AVENIO Tumor Tissue Expanded Kit (Plate A)	24テスト
518-114534	AVENIO Tumor Tissue Expanded Kit (Plate B)	24テスト
518-114541	AVENIO Tumor Tissue Surveillance Kit (Plate A)	24テスト
518-114558	AVENIO Tumor Tissue Surveillance Kit (Plate B)	24テスト

※Illumina社のNextSeq 500/550 によるシークエンシングが別途必要です。また、解析にはOncology Analysis Server (518-250454) が必要となります。
※こちらの製品は、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社から販売させていただいております。
本製品に関するお問い合わせは、下部にある「質問フォーム」からお送りください。折り返し、ロシュ社の担当者よりご連絡させていただきます。

定量キット

NGS用ライブラリ定量キットは、NGSシークエンサーのシークエンシング反応に対応したプライマーで増幅を行うため、実際に「シークエンス反応に利用できる」分子を定量します。

特長

GC、ATリッチでも安定した結果
バリデーション済みDNA定量スタンダード（希釈済み）が同梱

Cat.No	製品名	単位
07960140001 (KK4824)	KAPA Library Quantification Kit Illumina / Universal	500回用
07960204001 (KK4835)	KAPA Library Quantification Kit Illumina / ABI Prism	500回用
07960298001 (KK4854)	KAPA Library Quantification Kit Illumina / Roche LightCycler 480	500回用
07960336001 (KK4873)	KAPA Library Quantification Kit Illumina / ROX Low	500回用