日本ジェネティクスのテクニカルノートとは？
発売したばかりの新製品の性能評価や、既存製品の最適な条件を追求するための条件検討をすることでお客様に心からご納得頂いた上で商品をお使い頂けるよう、様々な評価試験を行っています。
採用前の検討資料として、または採用後の最適条件検討資料としてご活用ください。
また、当データに関するご質問はお気軽にページ下部のフォームよりお問い合わせください。
実験概要
FastGene™ VT1/VT2 Detection Kitは、モバイル リアルタイムPCR装置 PicoGene® PCR1100と組み合わせることで、食中毒の原因となる腸管出血性大腸菌の毒素（ベロ毒素（Vero toxin: VT） ）であるVT1、VT2を迅速に検出することができるキットである。
PicoGene® PCR1100向けに開発したキットではあるが、他のリアルタイムPCR装置でも使用することが可能であれば、サンプルをチューブに入れるだけで測定することができるため、検出の時間短縮が可能になると考えられる。
そこで、本資料ではFastGene™ VT1/VT2 Detection Kitをベンチトップ型リアルタイムPCR装置であるLightCycler 96、QuantStudio 5にて使用可能か検証を行った。
検証方法
| 使用キット | ： | FastGene™ VT1/VT2 Detection Kit（FastGene / Cat.No. FG-VT-16, FG-VT-96） |
| サンプル | ： | VT1・VT2 遺伝子検出用セット（陽性 Ctrl 付）（日本遺伝子研究所 / Cat.No.200203）の陽性Ctrlと同じ配列で合成したDNA（以下陽性コントロール） 弊社ラボで培養、DNA抽出を行ったDH5αコンピテントセルのゲノムDNA（以下gDNA） |
| サンプル調製方法 | ： | 陽性コントロールを、それぞれ10,000 copies/μL、1,000 copies/μL、100 copies/μL、10 copies/μLになるよう希釈し使用した DH5αコンピテントセルのgDNAは、20,000 copies/μL、2,000 copies/μL、200 copies/μL、20 copies/μLになるよう希釈し使用した |
| 使用装置 | ： | LightCycler® 96 System（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社 / Cat.No. 05815916001, 以下LC96） QuantStudio 5（Thermo Fisher SCIENTIFIC, 以下QS5） |
| 操作方法 | ： | FastGene™ VT1/VT2 Detection Kit のチューブに、VT1・VT2陽性コントロール各1 μL、gDNA 0.5 μLの計2.5 μLを加え、合計17 μLとした その後、キットのチューブのまま、それぞれの機器にてPCRを行った |
反応プログラム
| Step | Temp（℃） | Time（sec） | |
|---|---|---|---|
| Preincubation | 95 | 15 | |
| Amplification | 95 | 5 | x 45 cycles |
| 62 | 20 |
- LightCycler 96 Channel：FAM / Red 610 / Cy5
※ QuantStudio 5は、解析時Passive Referenceを「Non」に設定する
腸管出血性大腸菌による食中毒の原因遺伝子であるベロ毒素遺伝子（VT1，VT2遺伝子）を、リアルタイムPCR（PCR1100だけでなく通常のqPCR装置も含めて）により検出するためのキットです。
プライマー・プローブ配列は通知法通り（厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課長通知（平成26年11月20日））の物を使用し、蛍光はVT1をFAM、VT2をROX、ICをCy5で標識したマルチカラーディテクションキットとなります。1反応でベロ毒素遺伝子の検出はもちろん、VT1/VT2のタイピングまで可能です。
マスターミックスにはプライマー・プローブを混ぜて供給する為、ユーザーはDNAサンプルを混ぜるだけで測定可能なReady to Useタイプとなっております。
結果
増幅曲線
| LightCycler 96 | QuantStudio 5 | |
|---|---|---|
| VT1 (FAM) |
 |
 |
| VT2 (ROX) |
 |
 |
| IC (Cy5) |
 |
 |
ー10,000 copies ー1,000 copies ー100 copies ー10 copies
Ct値
| VT1 | VT2 | IC | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Quantity | LC96 | QS5 | LC96 | QS5 | LC96 | QS5 |
| 10,000 | 26.30 | 26.094 | 24.94 | 26.312 | 25.04 | 27.064 |
| 10,000 | 26.34 | 26.064 | 25.01 | 26.138 | 25.15 | 26.957 |
| 1,000 | 29.76 | 29.235 | 28.36 | 29.397 | 28.70 | 30.369 |
| 1,000 | 29.81 | 29.111 | 28.46 | 29.404 | 28.71 | 30.340 |
| 100 | 33.41 | 32.664 | 31.62 | 33.416 | 32.50 | 33.881 |
| 100 | 33.01 | 32.616 | 32.19 | 32.827 | 32.28 | 34.344 |
| 10 | 37.81 | 39.856 | 35.37 | 35.823 | 35.36 | 36.775 |
| 10 | 37.53 | 37.490 | 36.54 | 36.386 | 36.96 | 35.920 |
LightCycler 96、QuantStudio 5 ともに、10 copiesまで検出することが出来た
FastGene™ VT1/VT2 Detection Kitは、LightCycler 96、QuantStudio 5でも使用できることが確認できた。
また、検出感度も10 copiesまで検出できることが確認できた。
これらより、 FastGene™ VT1/VT2 Detection Kitは、 PicoGene® PCR1100以外のリアルタイムPCR装置でも使用できると考えられる。
