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| アプリケーションノート 2017＜23＞ 製品名：KAPA HyperPlus Kit（for illumina）（KK8510, KK8512, KK8514） メーカー名：KAPA BIOSYSTEMS 社 |
下記データは、早稲田大学 ナノ・ライフ創新研究機構 細川 正人 先生のご厚意により掲載させていただきました。
概要
多量サンプルを扱うRNA-seq実験において、ライブラリ作製にかかるコストは大きく、実験規模を制約することにつながる。
多くのキットでは、推奨量として1 ng以上のインプットcDNAが必要とされている。ところが、シングルセルRNA由来のcDNAなどでは、cDNA収量がわずかであり、貴重なサンプル消費が懸念材料となる。
コスト面とインプット量制限の課題を解消するため、1細胞用のRNA-seq(増幅cDNA)ライブラリ作製プロトコルであるSMART-seq2とKAPA HyperPlus Kitを組み合わせた改変ライブラリ作製方法を検討し、他社製品と比較した。
実験条件と実験手順
細胞から抽出した50 pgのtotal RNAを用い、SMART-seq2（Nature Protocols 9,171-181（2014））の手法によりcDNAを調製した。それを用い、インプットcDNA量やLigationおよびAmplificationの反応液量を改変した、いくつかの条件でライブラリー調製を行った。
• 生物種： ヒトがん細胞株
• 初発サンプル量： total RNA 50 pg
• RNA抽出方法： RNeasy mini kit（Qiagen社） DNase I 処理実施
• cDNA調製： SMART-seq2（Nature Protocols 9,171-181（2014））
• ライブラリ調製：
KAPA HyperPlus Kit（ライゲーションベース）I 社キットN（タグメンテーションベース）
• シーケンサー： Miseq
KAPA HyperPlus 反応条件
| サンプル ID |
プロトコール | インプットcDNA | アダプター （nM） |
グループ | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 濃度 （ng/uL） |
液量 （uL） |
cDNA量 （ng） |
||||
| S01 | スタンダード （推奨法） |
0.2 | 5 | 1 | 300 | K1 |
| S02 | ||||||
| S03 | ||||||
| S04 | L15_A12 | 0.2 | 1 | 0.2 | 1500 | K2 |
| S05 | ||||||
| S06 | ||||||
| S07 | 1 | 1 | 1 | K3 | ||
| S08 | ||||||
| S09 | ||||||
| S10 | 0.2 | 1 | 0.2 | 15000 | K4 | |
| S11 | ||||||
| S12 | ||||||
| S13 | 1 | 1 | 1 | K5 | ||
| S14 | ||||||
| S15 | ||||||
| S16 | L15_A15 | 0.2 | 1 | 0.2 | 1500 | K6 |
| S17 | ||||||
| S18 | ||||||
| S19 | 1 | 1 | 1 | K7 | ||
| S20 | ||||||
| S21 | ||||||
KAPA HyperPlus kit
Input DNA量：0.2 ng 1.0 ng
反応液量： L15_A12：Ligation 1/5量 Amplification 1/2 量で反応
L15_A15：Ligation 1/5量 Amplification 1/5 量で反応
増幅サイクル数：全条件15 サイクル
I 社キットN 反応条件
| サンプル ID |
インプット cDNA（ng） |
反応液量 | グループ |
|---|---|---|---|
| N.S01 | 1 （推奨法） |
1x | N1 |
| N.S02 | |||
| N.S03 | |||
| N.S04 | 0.25 | 0.25x | N2 |
| N.S05 | |||
| N.S06 | |||
| N.S07 | 0.5 | N3 | |
| N.S08 | |||
| N.S09 | |||
| N.S10 | 1 | N4 | |
| N.S11 | |||
| N.S12 |
I 社キットN
Input DNA量：0.25 ng 0.5 ng 1.0 ng
反応容量：1/4 量で反応
増幅サイクル数：全条件12 サイクル
データベースと解析ツール
| 項目 | バージョン |
|---|---|
| リファレンスゲノム | Ensembl Human Genome,Release 90 |
| アノテーションファイル | Ensembl Human GTF, Release 90, GTF |
| QC, フィルタリング | flexbar 2.4, fastq-mcf, FastQC 0.11.2 |
| ゲノムマッピング | HISAT2 2.0.5 |
| 遺伝子発現定量 | RSEM 1.3.0 |
| マッピング領域同定 | bedtools 2.26.0 |
| カバー率計算 | RSeQC（bam2wig.py） |
結 果
１．TapeStation によるライブラリーのサイズ確認
① KAPA HyperPlus を用いて作製したライブラリー
| Input DNA量 |
Adapter Stock | |||
|---|---|---|---|---|
| Library Amplification 50 μL |
Library Amplification 25 μL |
Library Amplification 10 μL |
||
| 300 nM | 1500 nM | 15000 nM | 1500 nM | |
| X 5 μL | X 1 μL | X 1 μL | X 1 μL | |
| 1 ng | K1（control） |
K3 |
K5 |
K7 |
| 0.2 ng | K2 |
K4 |
K6 |
|
② I 社キットN を用いて作製したライブラリー
| Input DNA量 |
1ng | 0.25ng | 0.5ng | 1.0ng |
|---|---|---|---|---|
N1（control） |
N2 |
N3 |
N4 |
KAPA HyperPlus で250 bp 付近にピークが見られるが、シーケンスにおいて特に問題とはならなかった。
2．シーケンス解析データ
※下部の「各解析データ」を参照ください。
まとめ
| 項目 | KAPA HyperPlus 結果 |
I 社キットN 結果 |
評価 |
|---|---|---|---|
| シーケンス精度 | Phred Score 38 にピーク、ただしその割合は I 社キットN より少ない | Phred Score 38 にピーク | KAPA ≦ I 社キットN |
| ミスマッチ | 約12% | 約8% | KAPA < I 社キットN |
| 挿入 | 約0.3% | 約0.3% | KAPA = I 社キットN |
| 欠損 | 約0.5% | 約0.5% | KAPA = I 社キットN |
| GC 含量 | 60%にピーク | 50～ 60%にピーク （コントロールと条件変更サンプルでプロファイルが異なる） |
KAPA > I 社キットN |
| シーケンスリード長 | cDNA 増幅アダプタ配列を含むためピークが複数※1 | cDNA 増幅アダプタがほとんど検出できないためピークは１つ※1 | KAPA > I 社キットN |
| ゲノムマップ率 | 40～ 60% （マップツールのパラメータで改善可能） |
70～80% | KAPA ≦ I 社キットN |
| インサートサイズ | 150～200 bp | 50～100 bp | KAPA > I 社キットN |
| 転写物カバー率 | 全体的に一定 | 3’側に偏る | KAPA > I 社キットN |
| 検出遺伝子数 | 約10,000 | 約10,000 | KAPA = I 社キットN |
| データ再現性 | 条件によって再現性が低い時がある | 条件が同じならば再現性は高い | KAPA < I 社キットN |
| 条件変化に対する 堅牢性 |
条件が変化してもあまり変化しない | 発現量が高いとばらつく | KAPA > I 社キットN |
| ばらつき | CV 上限：0.25 （1000 TPM） CV 上限：0.5 （100 TPM） CV 上限：1.0 （10 TPM） |
CV 上限：0.25 （1000 TPM） CV 上限：0.5 （100 TPM） CV 上限：1.5 （10 TPM） |
KAPA = I 社キットN （低発現遺伝子以外） KAPA < I 社キットN （低発現遺伝子） |
| 試験濃度依存性 | 濃度を変化させてもほぼコントロールと同等 | 濃度変化させると、高発現遺伝子の再現性がやや低下 GC 含量によって発現量の変化大 |
KAPA > I 社キットN （再現性） KAPA > I 社キットN （GC 含量による発現量の変化） |
※1（補足）
シーケンスリード長は、SMART-seq2 で使用しているcDNA 化およびPCR 時のアダプター配列を除去したあとのリード長を解析した。
したがって、特に短いリードは、もともとはPCR 後のアンプリコン末端を含んでいた配列であった。
KAPA HyperPlus はライゲーションベースのため、これらの配列がピークとして出て来ていると推察される。
一方、I 社キットN は、タグメンテーションベースのため、アンプリコン末端は原理的にリードとしてデータに出て来ないと推察される。
■ 総評
特に以下の点が評価され、KAPA HyperPlus のほうが優れていると判断された。
条件としてK6（Ligation1/5 量、Amplification1/5 量、インプットcDNA0.2 ng）でも運用可能と判断された。
• GC 含量による偏りが小さい
• インサートサイズが長い。
各解析データ
1．遺伝子発現定量の再現性
• 同条件でのサンプル間のばらつきを比較
• K7 を除き、いずれの相関係数も 0.99 以上で、ばらつきはほぼなかった。
KAPA HyperPlus
I 社キットN
2. コントロールとの比較
• K1, N1 をコントロールとして、再現性を比較
• KAPA HyperPlus ではコントロールとの整合性が高かった。
• I 社キットN は、N2 を除き、高発現領域の遺伝子の再現性が低かった。
KAPA HyperPlus
I 社キットN
3．KAPA HyperPlus とI 社キットN の比較（GC 含量および長さの影響）
• K1（KAPA HyperPlus）とN1（ I 社キットN）を比較
• GC 含量によって発現量に偏りの発生が見られた。
• 一方、長さによる影響は見られなかった。
4．各サンプルのGC 含量ごとの平均遺伝子発現量
• I 社キットN はGC 含量が低い遺伝子の方に発現量に偏りが見られた。
• KAPA HyperPlus では、各条件で安定してコントロールと同じ傾向を示した。
5．各サンプルのインサートサイズの分布
• マッピングの結果から、インサートサイズを計算した。
• インサートサイズは KAPA HyperPlus の方が長かった。
I 社キットN ：インサートサイズ最頻値100 bp 以下
KAPA HyperPlus ：インサートサイズ最頻値150 ～ 200 bp
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