【お客様事例】フェノール抽出試薬とスピンカラム法を用いたFastGene™ miRNA Enhancerの有用性

日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？

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アプリケーションノート　2020＜04＞
製品名：FastGene™ miRNA Enhancer（Cat.No.FG-RNAE-S, FG-RNAE-25）
　　　　FastGene™ RNA Premium kit（Cat.No.FG-81006, FG-81050, FG-81250）
メーカー名：日本ジェネティクス株式会社

製品名：TRIsure（Cat.No.BIO-38032）
メーカー名：BIOLINE社

下記データは、社会医療法人大雄会医科学研究所澤村卓宏様のご厚意により掲載させていただきました。

概要

FastGene™ miRNA Enhancerは、市販のカラム法を用いたRNA抽出キットと組み合わせることによって、miRNAの効果的な回収を可能にする試薬です。これまで、FastGene™ RNA Premium kit のような非フェノール法を用いた抽出方法において使用実績がありましたが、酸性フェノール法を用いた抽出法での効果が得られるかは未知でした。
本アプリケーションノートでは、FastGene™ RNA Premium kit の抽出工程を、 TRIsureを用いた酸性フェノール抽出法で行い* 、 miR-21のターゲットにその収量評価を行いました。
その結果、FastGene™ miRNA Enhancerは、TRIsure を用いた抽出においても、miR-21回収量を増加させることがわかりました。
* 本アプリケーションノート記載のmiRNA抽出方法は、FastGene™ RNA Premium kit およびFastGene™ RNA Basic Kitでご使用いただけます。

実験条件

細胞
　細胞株 K562
　細胞数105 個調整したペレット（n=2）
RNA抽出方法
　巻末補足情報に記載
RNA収量／純度測定方法
　吸光光度計、DeNovix DS-11使用　
RNA回収量検証方法
　RT-qPCRにて検証（詳細は巻末補足情報に記載）

サンプル情報

サンプル		抽出	カラム精製	FastGene™ miRNA Enhancer
①	Kit 抽出＋ Kit 精製＋ Enhancer（ー）	FastGene™ RNA Premium kit		未添加
②	Kit 抽出＋ Kit 精製＋ Enhancer（＋）	FastGene™ RNA Premium kit		添加
③	TRI ＋ Kit 精製＋ Enhancer（ー）	TRIsure	FastGene™ RNA Premium kit	未添加
④	TRI ＋ Kit 精製＋ Enhancer（＋）	TRIsure	FastGene™ RNA Premium kit	添加
➄	TRI ＋ EtOH purification	TRIsure	使用せず（エタ―ノール沈殿のみ）	使用せず

使用キット・試薬

　
FastGene™ miRNA Enhancer
お手持ちのRNAキットに加えるだけで、miRNAを効率的に回収することができる試薬。
※ 本製品はスピンカラムを用いた抽出法において、カラムの担体に対してsmall RNAの結合を促進するものです。

　
FastGene™ RNA Premium kit
「高品質を低価格で」がコンセプトFastGene™製RNA精製キット。

　
TRIsure
フェノール含有RNA抽出試薬。

結果

結果１：抽出RNAの純度・収量比較

サンプル		吸光度測定結果
サンプル		A260	260/280	260/230	濃度 (ng/μL)	収量 (μg)
①	Kit 抽出＋ Kit 精製＋ Enhancer（ー）	1.03	2.18	2.68	41.13	2.06
①	Kit 抽出＋ Kit 精製＋ Enhancer（ー）	1.41	2.18	2.64	56.42	2.82
②	Kit 抽出＋ Kit 精製＋ Enhancer（＋）	0.74	2.19	2.64	29.71	1.49
②	Kit 抽出＋ Kit 精製＋ Enhancer（＋）	0.84	2.18	2.50	33.68	1.68
③	TRI ＋ Kit 精製＋ Enhancer（ー）	0.67	2.20	2.31	26.80	1.34
③	TRI ＋ Kit 精製＋ Enhancer（ー）	0.63	2.01	1.75	25.19	1.26
④	TRI ＋ Kit 精製＋ Enhancer（＋）	0.95	2.22	2.59	37.86	1.89
④	TRI ＋ Kit 精製＋ Enhancer（＋）	0.94	2.18	2.38	37.61	1.88
➄	TRI ＋ EtOH purification	2.00	1.60	1.98	80.02	4.00
➄	TRI ＋ EtOH purification	2.13	1.61	1.78	85.24	4.26
※各2回抽出精製（n=2）

• FastGene™ RNA Premium kit 付属のカラム精製を用いた場合（サンプル①～④）は、純度が高く（260/280 、2.0以上）、収量は1.2 μg ～2.8 μg の範囲で回収された。
• カラム精製を行わなかった条件（サンプル⑤）は、RNA純度が低い。
• FastGene™ RNA Premium kitを用いて場合、TRIsureを用いた場合共に、 miRNA Enhancer 添加の有無で、RNA抽出の純度に顕著な差は見られなかった（サンプル①と②、③と④の比較）。

結果2：回収したDNA溶液中（総量50 μL）に含まれるRNA量

（i） RT-qPCR結果（GAPDH）	（ii）RT-qPCR結果（miR-21）

※各2回（抽出精製、n=2）の平均値として表示

• miRNA Enhancer 添加前後で、GAPDH mRNAの回収量に顕著な差は見られなかった（結果2（i））。
• FastGene™ RNA Premium kit に従い抽出した場合（kit 抽出）、TRIsure を使用し抽出した場合共に、 miR-21収量は大きく増加した（結果2（ii））。
→ miRNA Enhancer の効果は、フェノール抽出法においても、遜色なく得られた。

結論

miRNA Enhancerは、miRNAの収量を大きく増加させることが確認できたことに加え、本製品は、酸性フェノール抽出法を用いるTRIsure使用時においても有用な手段となることが示された。

TRI sureは簡便にRNAが抽出可能でとても身近な試薬です。これを組み合わせることでより多くのマイクロRNAの収量が得られました。

補足説明

（i）：RNA抽出・精製方法詳

リアルタイムPCRの条件

miR-21解析に用いたステムループRTプライマーとcDNA合成

miR-21解析に用いたリアルタイムPCR時のプライマー配列、プローブ、反応条件および反応液

GAPDH遺伝子のcDNA合成

GAPDH遺伝子解析に用いたプライマー配列、反応条件および反応液

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