【お客様事例】FastGene™ ScriptaseⅡと他社キットの RT-PCRによる比較評価

日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？

当社製品を実際にご使用頂いた、正真正銘、日本国内の研究者様による評価データ
製品をご検討中の方はもちろん、すでにお使いのお客様におかれましても、類似の研究をされている他の研究者の方の事例集としてご活用頂けます

アプリケーション検索専用ページはこちら

アプリケーションノート　2018＜19＞
製品名：FastGene™ Scriptase Ⅱ（NE-LS53）
メーカー名：日本ジェネティクス株式会社

下記のデータは、国内公的研究機関田村拓様のご厚意により掲載させていただきました。

FastGene™ Scriptase Basicの性能評価を行うため、HeLa 細胞から抽出
したRNAを、本製品と既存の逆転写酵素にて、それぞれ逆転写反応を
行いました。
得られたcDNAは、PCRにてターゲット遺伝子を増幅し、電気泳動にて
確認を行いました。
バンドのシグナルを比較することで、FastGene™ Scriptase Basicの
性能評価を行いました。

FastGene™ ScriptaseⅡの性能評価を行うため、HeLa 細胞から抽出した
RNAを、本製品と既存の逆転写酵素にて、それぞれ逆転写反応を行いました。
得られたcDNAは、PCRにてターゲット遺伝子を増幅し、電気泳動にて確認を行いました。
バンドのシグナルを比較することで、 FastGene™ ScriptaseⅡの性能評価を行いました。

概要

FastGene™ ScriptaseⅡの性能評価を行うため、HeLa 細胞から抽出したRNAを、本製品と既存の逆転写酵素にて、それぞれ逆転写反応を行いました。
得られたcDNAは、PCRにてターゲット遺伝子を増幅し、電気泳動にて確認を行いました。
バンドのシグナルを比較することで、 FastGene™ ScriptaseⅡの性能評価を行いました。

実験

● RNA抽出
サンプル：HeLa 細胞を35 mm dish で培養し 80-90% confluent の時点で使用した。
RNA抽出：Ribozol（エムエステクノシステムズ）（N580-100ML ）
吸光度測定：U-3900（ HITACHI ）（U-3900）
結果：A260/280=1.72, yield=41.5 μg

● 逆転写酵素反応
Total RNAを1, 10, 100 ng/1 μLとなるように希釈した。それぞれTemplate RNAとして1 μLずつ添加した。
※ 0 ngは1 μL H2O

● 逆転写反応 Primer
Gene specific primer（GAPDH）： CTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC

FastGene™ Scriptase Ⅱ
Template RNA（0, 1, 10, 100 ng/μL）： 1 μL
Gene specific primer（ GAPDH）　： 2 μL（2 pmol）
dNTP Mixture（2 mM each）　　　： 2 μL
Sterile water（ RNase free）　　　： 7.5 μL　　　　
total 　　　　　　　　　　　　　　： 12.5 μL
↓
65 ℃ 5 min
↓
4 ℃ 5 min
↓
add
5X FastGene™ Scriptase Ⅱ buffer 　： 4 μL
0.1 M DTT（ kit付属）　　　　　： 2 μL
FastGene™ Scriptase Ⅱ 　　　　　： 1 μL
↓
42 ℃　50 min
↓
70 ℃　15 min
↓
keep at 22 ℃

参考：Template total RNA推奨量：1 ng-5 μg

T社逆転写反応キット
Template RNA（0, 1, 10, 100 ng/μL）： 1 μL
Gene specific primer（ GAPDH）　： 2 μL（2 pmol）
2 mM dNTP 　　　　　　　　　　　： 5 μL
RNase free dH2O 　　　　　　　　： 2 μL
total 　　　　　　　　　　　　　　： 10 μL　　　　　
↓
65 ℃ 5 min
↓
4 ℃ 5 min
↓
add
5X buffer 　　　　　　　　　　　　　：4 μL
逆転写酵素　　　　　　　　　　　　：1 μL
RNase free dH2O 　　　　　　　　　：5 μL
↓
42 ℃　50 min
↓
70 ℃　15 min
↓
keep at 22 ℃

参考：Template total RNA推奨量：5 μg以下

　　PCR条件　　

● 反応組成
10 μM Forward Primer	：	2.5 μL
10 μM Reverse Primer	：	2.5 μL
2 mM dNTPs（TOYOBO）	：	5 μL
5X Phusion HF Buffer	：	10 μL
cDNA	：	2 μL
sterile water	：	27.5 μL
Phusion DNA Polymerase（NEB）	：	0.5 μL
total ： 50 μL	：	50 μL

● プログラム

95 ℃	2 min
↓
95 ℃	10 sec	30 cycles
65 ℃	30 sec
72 ℃	30 sec
↓
72 ℃	3 min
↓
hold	22 ℃

● Primers 配列-GAPDH

Forward Primer	：CCACAGTCCATGCCATCAC
Reverse Primer	：CCATGAGGTCCACCACCC
増幅産物サイズ	：500bp

　　電気泳動条件　　

アガロースゲル	：	1% agarose gel
サンプル	：	PCR 反応液 15 μL
泳動バッファー	：	1xTAE
泳動条件	：	100 V, 30 min
ラダーマーカー	：	7 μL（Gene Ladder Wide 1）（日本ジーン）（313-06961）