【お客様事例】KAPA HiFi HotStart 酵素を用いた少数T細胞（25～400個）からの遺伝子増幅

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アプリケーションノート 2016<13>

製品名：KAPA HiFi HotStart ReadyMix（KK2601）
メーカー名：KAPA BIOSYSTEMS 社

下記のデータは、日本学術振興会特別研究員PD 大阪大谷大学薬学部免疫学講座池渕良洋様のご厚意により掲載させていただきました。

方法

少数T細胞群の遺伝子配列を調べるため、T細胞溶解液からcDNAを合成し、PCRにより遺伝子の増幅を行った。

● サンプルの条件

Template
No1	T細胞400個分のcDNA溶液
No2	T細胞100個分のcDNA溶液
No3	T細胞 25個分のcDNA溶液
No4	Negative Control (T細胞なし)

T 細胞溶解液：0.2%TritonX-100

● PCR reaction mixture
<KAPA> （µL)
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 　7.5
Primer A 　　　　　　　　　　　 0.6
Primer B 0.6
DDW 2.3
Template 4
Total 15μL

● PCR condition
<KAPA>
98℃　　 3 min
98℃　　 20 sec 　×5
72℃　　 45 sec
98℃ 　　20 sec
70℃　　15 sec　 ×5
72℃　　 45 sec
98℃ 　　20 sec
68℃ 　　15 sec　 ×25
72℃ 　　45 sec
72℃　　 5 min
4℃ 　　　∞

<TO社製品> （µL)
×10 PCR Buffer　　　 1.5
2mM dNTPs 　　　　 1.5
25mM MgSO4 0.9
Primer A 0.6
Primer B 0.6
ポリメラーゼ 0.3
DDW 5.6
Template 4
Total 15μL

<TO社製品>
94℃ 　　2 min
98℃ 　　10 sec 　×5
72℃ 　　45 sec
98℃ 　　10 sec　 ×5
70℃ 　　45 sec
98℃ 　　10 sec 　×25
68℃ 　　45 sec
68℃ 　　7 min
4℃ 　　　∞

<TA社製品> 　（µL)
×10 PCR Buffer 　　1.5
×50 dNTP　　　　 0.3
Primer A 0.6
Primer B 0.6
ポリメラーゼ 0.3
DDW 7.7
Template 4
Total 15μL

<TA社製品>
95℃ 　　30 sec
95℃　　 5 sec 　×5
72℃　　 120 sec
95℃　　 5 sec
70℃　　 10 sec 　×5
72℃ 　　120 sec
95℃ 　　5 sec
68℃ 　　10 sec 　×25
72℃ 　　120 sec
4℃ ∞