日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？
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メーカー名：KAPA BIOSYSTEMS 社
以下のアプリケーションデータは埼玉県立がんセンター 腫瘍診断・予防科
山本 剛 様、 角田 美穂 様、 部長 赤木 究 様のご厚意により掲載させていただきました。
実験方法
遺伝性大腸がん原因遺伝子のひとつPMS2遺伝子をターゲットとした長鎖アンプリコンのシーケンスでは、特にATリッチ領域におけるライブラリー増幅バイアスによりリード数が減少し、カバレッジが低くなることが問題となっていた。
今回、現行法である「長鎖アンプリコンからNextera XTで作成したTagmentation後のライブラリー」において、KAPA Library Amplification Kit（KAPA HiFi HotStart ReadyMix）を用いてライブラリーを増幅することで、この問題点の改善を試みた。
ワークフロー
※KAPA Library Amplification Kitによるライブラリー増幅
① Tagmentationの中和ステップ後、25μlの反応液に２倍量（50μl）の AMPureXPを添加し、クリーンナップを実施（80％エタノール洗浄×2回）
② 15μl の10mM Tris-HCl, pH 8 あるいは PCR-grade water で溶出
③ 以下の条件でライブラリー増幅を実施
■反応組成
2×KAPA HiFi HS ReadyMix 25μL
Index 1 primer 5μL
Index 2 primer 5μL
Library DNA 15μL
50μL RXN
■PCR サイクル
initial Extension 72℃ 3min
Denaturation 98℃ 30sec
Denaturation 98℃ 10sec
Annealing 63℃ 30sec ×14cycles
Extension 72℃ 3min
Hold 10℃
＜現行法＞
PMS2遺伝子を標的とした長鎖アンプリコンシーケンスの結果
ATリッチ領域（例えば矢印の領域）などではリードが減少し、カバレッジの低下が見られる。
結果
KAPA Library Amplification（LA）Kitを用いてライブラリー増幅を行った結果、ATリッチ領域でのカバレッジの改善が見られ、より平均的なカバレッジを得ることができた。
他のサンプル（下段サンプルB）でも同様に、KAPA LA Kitを用いてライブラリー増幅した結果、カバレッジの改善が見られた。
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