【製品性能評価】Pippin Pulseを用いたパルスフィールド電気泳動による様々な長さの断片化DNA（600 bp, 350 bp, 200 bp, 150 bp）のサイズ分布確認

日本ジェネティクスのテクニカルノートとは？

発売したばかりの新製品の性能評価や、既存製品の最適な条件を追求するための条件検討をすることでお客様に心からご納得頂いた上で商品をお使い頂けるよう、様々な評価試験を行っています。
採用前の検討資料として、または採用後の最適条件検討資料としてご活用ください。
また、当データに関するご質問はお気軽にページ下部のフォームよりお問い合わせください。

目的

パルスフィールド電気泳動で様々な長さに断片化したDNAのサイズ分布を確認する。

背景

次世代シーケンスなどのいくつかのアプリケーションにおいて、目的のサンプルがどの程度のサイズに分布しているかを確認することはダウンストリームの成功率を上げる上でも、非常に重要となります。
一般的に、キャピラリ電気泳動システムは、サンプルが少なくてもサイズが確認できるため、優れた装置として知られていますが、サンプルによってはテーリングが生じ、正確なサイズ分布が得られないことがあります。

パルスフィールド電気泳動は、電気泳動中に電界の方向を切り替えることで、DNA断片をより精度よく分離し、ゲルに展開することが可能です。
本技術資料では、簡便で使いやすいパルスフィールド電気泳動パワーサプライPippin Pulseを用いて、さまざまな長さの断片化DNA（600 bp,350 bp, 200 bp, 150 bp）を電気泳動し、GelPro analyzerを使用して解析することにより、目的とする長さのDNA断片を解析した事例をご紹介します。

実験条件

• サンプルDNA：Plant genomic DNA, Human genomic DNA
• Input DNA量：1000 ng, 100 ng, 10 ng, 1 ng
• Input DNAバッファー組成：TE buffer : 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0
• 断片化酵素：KAPA Frag(Cat.No.KK8600)
• 断片化温度：37℃
• 断片化時間：5 min, 10 min, 20 min, 30 min

実験手順

1. ゲルシステムをセットアップ（ゲル作製、サンプルロード）する。
2. PCとPippin PulseをUSB接続し、それぞれの電源をONにする。
3. PCのディスクトップにあるPippin Pulse Iconをダブルクリックして
　アプリケーションを立ち上げる。

7. 泳動が完了したらゲルを解析する。

　　※注意：泳動中のPCトラブルを避けるために、下記の設定に注意。
　　　　　　　• PCの電源ケーブルの接続
　　　　　　　• 省電力設定のスリープをOFFに設定
　　　　　　　• Windows updateをOFFに設定

断片化後のサイズ分布結果 

※AdapterをLigationせずに、断片化後、熱変性により反応を中断

● Plant genomic DNAとHuman genomic DNAの断片化結果
   日本ジェネティクス社　社内ラボ評価試験データ

Blue : Plant genomic DNA　Red : Human genomic DNA

断片化時間/ Input DNA量	5 min Target size 600 bp	10 min Target size 350 bp	20 min Target size 200 bp	30 min Target size 150 bp
1000ng	Top peak： 967 bp　1147 bp	Top peak： 596 bp　515 bp	Top peak： 293 bp　217 bp	Top peak： 165 bp　169 bp
100ng	Top peak： 808 bp　920 bp	Top peak： 388 bp　347 bp	Top peak： 181 bp　173 bp	Top peak： 117 bp　117 bp
10ng	Top peak： 870 bp　639 bp	Top peak： 420 bp　380 bp	Top peak： 138 bp　264 bp	Top peak： 124 bp　149 bp
1ng	Top peak： not detected	Top peak： not detected	Top peak： not detected	Top peak： not detected

Bioanalyzerの測定レンジでは「高分子の切れ残りが検出できない可能性」があるためパルスフィールド電気泳動を用いて200 bp ～ 40 kbの広いレンジでサイズ確認した。

泳動レーン：
　Lane H : High Marker, Invitrogen社 1 kb DNA extension ladder (#10511-021), 2 uL/lane
　Lane L : Low Marker, Bioline社 HyperLadder 1 kb (#BIO-33025), 5 uL/lane
　Lane M : Bioline社 HyperLadder 100 bp (#BIO-33029), 5 uL/lane
　サンプルレーン ：Plant genomic DNA・Human genomic DNA共に1000 ng断片化サンプルを用いて200 ng/Laneで泳動

パルスフィールド泳動条件：
　パワーサプライ ：SageScience社 Pippin Pulse, 2-50 kb program 16 hr
　泳動槽 ：MajorScience社 Midi plus-2, 15×15 cm ゲルトレイ
　泳動バッファー ：SageScience社 KBB buffer (#KBB1001), 終濃度x0.5
　泳動時間：6 hr
　アガロース：FastGene™ Agarose (#NE-AG02), 1.2% 120 ml

Gel-Pro Analyzerによる解析　Input DNA量 1,000 ng

＊注意＊
X軸の値：Gel-Pro Analyzerは、Bioanalyzerとは逆

	Plant genomic DNA
		Gel-Pro Analyzer 解析 X軸の値：Gel-Pro Analyzerは、Bioanalyzerとは逆
		LaneP　  　断片化前	Lane1
		Lane2	Lane3
	LaneM	Lane4

	Human genomic DNA
		Gel-Pro Analyzer 解析
		LaneP　  　断片化前	Lane1
		Lane2	Lane3
	LaneM	Lane4

● Top peakのsizeの比較

［Pippin Pulse］
	Pippin Pulse（パルスフィールド電気泳動パワーサプライ） PPI0200 Pippin Pulse用 10 X KBB Buffer KBB1001 MidiPlus2 水平式電気泳動装置 （UVトレイ3 種類、1 mm厚 20サンプルコーム、 　UVトレイダム、電極コード赤黒） ME1571015 1.5 mm厚 16 サンプルコーム MC ME15-16MC-1.5

［KAPA HyperPlus Kit］
	KAPA社 ライブラリー 調製キット KAPA HyperPlus Kit KK8510 8 回用 KK8512 24 回用 KK8514 96 回用	・キット内容
		・KAPA Frag Enzyme ・KAPA Frag Buffer (10X) ・KAPA Frag 　Conditioning Solution ・End Repair & A-Tailing 　Buffer ・End Repair & A-Tailing 　Enzyme	・Ligation Buffer ・DNA Ligase ・KAPA HiFi HotStart 　ReadyMix (2X) ・Library Amplification 　Primer Mix (10X)

［マグネットスタンド］
	MagnaStand（YS-Model) 8 Ch×0.2 ml PCRチューブ用 FG-SSMAG2
	MagnaStand 8 Ch×1.5 mlチューブ用 FG-SSMAG1.5
	MagnaStand（YS-Model） 96 wellプレート用 FG-SSMAG96 MagnaStand（YS-Model） V2 微量対応モデル （AMPure Low Volume Elution 対応マグネット） FG-SSMAG96SLV
お客様の声から生まれた、爆発的ヒット商品次世代シーケエンス（NGS）用ライブラリー調製では、AMPure XPビーズを用いたサンプルクリーンアップの工程が何回かあります。 従来のマグネットスタンドは磁力が弱いため、ピペッティングでの溶液ミックスや、溶液回収の際のビーズキャリーオーバーが問題でした。このマグネットスタンドは、NGSライブラリー調製に特別に開発されており、強力な磁力でAMPure XPのハンドリングをストレスなく行うことが出来ます。

［磁気ビーズ］		［試薬調整 　チューブラック］		［PCR装置］
Agencourt® AMPure® XP Kit A63880 5 mL A63881 60 mL A63882 450 mL		アイスオン1型・2型 SKIO-1（169×69×47） SKIO-2 （177×95×47）		LifeECO TC-96GHbC Heat Lid の温度設定が可能です。

［消耗品］
0.2 mL 8 連PCRチューブwithキャップ FG-088WD（ドームキャップ） FG-088WF（フラットキャップ） チューブ1個単体で蓋を開閉することができ、コンタミネーションを予防します。	マイクロ遠心チューブ 11150　0.65 mL 11510　1.7 mL 12000　2.0 mL
10 uL ワンタッチフィルター 10320 ゴムのような柔らかいプラスチックによりピペットへの装置が良く高い分注精度が得られます。	200 uL マルチガード 14220 14220T　Low Biinding（低吸着）

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