日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？
- 当社製品を実際にご使用頂いた、正真正銘、日本国内の研究者様による評価データ
- 製品をご検討中の方はもちろん、すでにお使いのお客様におかれましても、類似の研究をされている他の研究者の方の事例集としてご活用頂けます
アプリケーション検索専用ページはこちら
| アプリケーションノート 2018＜20＞ 製品名：FastGene™ Scriptase Basic（NE-LS52） メーカー名：日本ジェネティクス株式会社 |
下記のデータは、国内公的研究機関 田村 拓 様のご厚意により掲載させていただきました。
概要
 |
FastGene™ Scriptase Basicの性能評価を行うため、HeLa 細胞から抽出した RNAを、本製品と既存の逆転写酵素にて、それぞれ逆転写反応を行いました。 得られたcDNAは、PCRにてターゲット遺伝子を増幅し、電気泳動にて 確認を行いました。 バンドのシグナルを比較することで、FastGene™ Scriptase Basicの 性能評価を行いました。 |
実験
● RNA抽出
サンプル：HeLa 細胞を35 mm dish で培養し 70-80% confluent の時点で使用した。
RNA抽出：Ribozol（エムエステクノシステムズ）（N580-100ML ）
吸光度測定：U-3900（ HITACHI ）（U-3900）
結果：A260/280=1.56, yield=9.5 μg
● 逆転写酵素反応
Total RNAを1, 10, 100 ng/1 μLとなるように希釈した。それぞれTemplate RNAとして1 μLずつ添加した。 ※ 0 ngは1 μL H2O
● 逆転写反応 Primer
Gene specific primer（GAPDH）： CTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC
FastGene™ Scriptase Basic
Template RNA（0, 1, 10, 100 ng/μL） ： 1 μL
Gene specific primer（ GAPDH） ： 2 μL（2 pmol）
↓
42 ℃ 5 min
↓
add
10X FastGene™ Scriptase buffer ： 2 μL
dNTP Mixture（2 mM each） ： 2 μL
FastGene™ Scriptase basic ： 1 μL
Sterile water（RNase free） ： 12 μL
total ： 20 μL
↓
42 ℃ 60 min
↓
90 ℃ 5 min
↓
keep at 22 ℃
Template RNA（0, 1, 10, 100 ng/μL） ： 1 μL
Gene specific primer（ GAPDH） ： 2 μL（2 pmol）
↓
42 ℃ 5 min
↓
add
10X FastGene™ Scriptase buffer ： 2 μL
dNTP Mixture（2 mM each） ： 2 μL
FastGene™ Scriptase basic ： 1 μL
Sterile water（RNase free） ： 12 μL
total ： 20 μL
↓
42 ℃ 60 min
↓
90 ℃ 5 min
↓
keep at 22 ℃
参考：Template total RNA推奨量：1 ng-5 μg
T社逆転写反応キット
Template RNA（0, 1, 10, 100 ng/μL） ： 1 μL
Gene specific primer（ GAPDH） ： 2 μL（2 pmol）
2 mM dNTP ： 5 μL
RNase free dH2O ： 2 μL
total ： 10 μL
↓
65 ℃ 5 min
↓
4 ℃ 5 min
↓
add
5X buffer ：4 μL
逆転写酵素 ：1 μL
RNase free dH2O ：5 μL
↓
42 ℃ 50 min
↓
70 ℃ for 15 min
↓
keep at 22 ℃
Template RNA（0, 1, 10, 100 ng/μL） ： 1 μL
Gene specific primer（ GAPDH） ： 2 μL（2 pmol）
2 mM dNTP ： 5 μL
RNase free dH2O ： 2 μL
total ： 10 μL
↓
65 ℃ 5 min
↓
4 ℃ 5 min
↓
add
5X buffer ：4 μL
逆転写酵素 ：1 μL
RNase free dH2O ：5 μL
↓
42 ℃ 50 min
↓
70 ℃ for 15 min
↓
keep at 22 ℃
参考：Template total RNA推奨量：5 μg以下
PCR条件
| ● 反応組成 | ||
| 10 μM Forward Primer | ： | 2.5 μL |
| 10 μM Reverse Primer | ： | 2.5 μL |
| 2 mM dNTPs（TOYOBO） | ： | 5 μL |
| 5X Phusion HF Buffer | ： | 10 μL |
| cDNA | ： | 2 μL |
| sterile water | ： | 27.5 μL |
| total ： 50 μL | ： | 50 μL |
● プログラム
| 95 ℃ | 2 min | ||
| ↓ | |||
| 95 ℃ | 10 sec |  |
30 cycles |
| 65 ℃ | 30 sec | ||
| 72 ℃ | 30 sec | ||
| ↓ | |||
| 72 ℃ | 3 min | ||
| ↓ | |||
| hold | 22 ℃ |
● Primers 配列-GAPDH
| Forward Primer | ：CCACAGTCCATGCCATCAC |
| Reverse Primer | ：CCATGAGGTCCACCACCC |
| 増幅産物サイズ | ：500bp |
電気泳動条件
| アガロースゲル | ： | 1% agarose gel |
| サンプル | ： | PCR 反応液 15 μL |
| 泳動バッファー | ： | 1xTAE |
| 泳動条件 | ： | 100 V, 30 min |
| ラダーマーカー | ： | 7 μL（Gene Ladder Wide 1）（日本ジーン）（Code No. 313-06961） |
結果
| Scriptase Basic | T 社 |
 |
 |
Scriptase Basic は少ないRNA量でPCRのバンドを確認することができた。
Scriptase Basicは比較的安価なため、コストパフォーマンスが良く、満足しています。 チューブのラベルが色分けされているので、使い勝手も良いです。
- こちらのアプリケーションノートのPDFダウンロード ： こちら
- 製品情報詳細ページ： FastGene™ Scriptase Basic
- アプリケーションノート検索ページ（型番・キーワード・アプリケーションから検索可能）
