【お客様事例】シリカドライした葉から抽出した増幅困難な葉緑体DNAのPCR

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アプリケーションノート 2016<01>

製品名：KAPA2G Robust HotStart ReadyMix with Dye（KK5706）
メーカー名：KAPA BIOSYSTEMS 社

下記のデータは、国立研究開発法人森林総合研究所森林遺伝研究領域生態遺伝研究室鈴木節子様のご厚意により掲載させていただきました。

実験条件

今まで使用していた酵素は、生の葉から抽出したDNAでは安定的にPCR増幅を行うことができていましたが、シリカゲルドライした葉から抽出したDNAではPCR増幅が困難になりました。
そこで、「お客様からの製品フィードバック2013〈11〉」を読み、植物乾燥標本からのDNAからも増幅が得られることを知り、KAPA2G Robust HotStart ReadyMix with DyeによるPCR増幅を試みました。

DNA抽出方法：CTAB法
TA社とKAPA2G Robust HotStart ReadyMixの酵素を比較しました。

● PCR 装置
ABI GeneAmp 9700
● 増幅サイズ 　
matK：850bp
trnQ-rps16：1060bp

● TA社の反応組成
TA社酵素　　　　　 0.05
10×Buffer　　　　 1
dNTP Mix 0.8
Primer Forward (2μM) 0.5
Primer Reverse (2μM) 0.5
D.W. 5.15
DNA 2
Total 10μl

● TA社のPCRプログラム
94℃ 3：00
94℃    0：30
50℃    1：00 ×40 cycle
72℃    1：30
72℃ 10：00
4℃ forever
total反応時間；約2.5～3時間

● KAPA2G Robust HotStart ReadyMixの反応組成
2×KAPA 5
Primer Forward (10μM) 0.5
Primer Reverse (10μM) 0.5
D.W. 0
DNA 4
Total 10μl

● KAPA2G Robust HotStart ReadyMix PCRプログラム

〈trnQ-rps16〉　　　　　　　　　　〈matK〉
94℃ 3：15 94℃　　　3：00
94℃ 0：15　　　　　　　　　　 94℃　　　0：15
58℃ 0：15 ×38 cycle 55℃　　　0：15 ×35 cycle
72℃ 0：30 72℃　　 0：30
72℃ 10：00　　　　　　　　　　 72℃　 10：00　
4℃ forever 4℃ forever
total反応時間；約1時間

結果

M 100bp ラダー
1. サンプル１　 KAPA 　　　trnQ-rps16
2. サンプル２　KAPA 　　　trnQ-rps16
3. サンプル１　TA 社酵素　 trnQ-rps16
4. サンプル２　 TA 社酵素　 trnQ-rps16
5. サンプル１　 KAPA 　　　matK
6. サンプル２　 KAPA 　　　matK
7. サンプル１　TA 社酵素　 matK
8. サンプル２　TA 社酵素　matK

生の葉から抽出したDNAでは、どのようなTaqを用いてもうまく増幅できていたのですが、フィールドで採取直後にシリカゲルで急速乾燥した葉から抽出したDNAでは、増幅が見られなくなってしまいました。
その時、KAPA2G Robust HotStart ReadyMix（KK5706）の製品フィードバックを読み、乾燥標本のDNAからも増幅が得られることを知り、KAPA2G Robust HotStart ReadyMixを試してみました。
KAPA社キットでは、その結果、見事に増幅に成功し、塩基配列も無事に得ることが出来ました。増幅が安定しているだけでなく、反応時間が短い（1時間くらい）ことも素晴らしいです。
Dyeがはじめから入っているのでアガロースゲル電気泳動の際に便利でした。