日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？
- 当社製品を実際にご使用頂いた、正真正銘、日本国内の研究者様による評価データ
- 製品をご検討中の方はもちろん、すでにお使いのお客様におかれましても、類似の研究をされている他の研究者の方の事例集としてご活用頂けます
アプリケーション検索専用ページはこちら
|
アプリケーションノート 2018＜18＞ |
下記のデータは、静岡県立大学 栄養生理学研究室 本間一江様のご厚意により掲載させていただきました。
検討の背景
ラットの腸間膜脂肪組織から抽出したRNAを用いて発現定量解析を行ってきました。FastGene™ Scriptase Ⅱ cDNA Synthesis（NE-LS63） からcDNAの合成を行いましたが、酵素の添加ステップや、RNAの高次構造を解くステップに対して、若干操作上の手間を感じていました。
今回、qPCR用に特化されたFastGene™ Scriptase Ⅱ Master Mix（5X）（NE-LS64）を使用したところ、必要な試薬類がすでに混合されており、また操作のステップも少ない分、簡便に使用することが出来ました。
実験
未処置のControlラットとSTZ（※）を投与した糖尿病モデルラットを用いた。
 |
|
|
A：Control 8 匹 ※ STZ：ストレプトゾシン RNA抽出： QIAGEN RNeasy（74104） |
 サンプルによってRNA 濃度が違うため、400 ng となるように添加した。 |
実験結果
qPCR結果
● Cq値
ターゲット遺伝子：Adiponectin
リファレンス遺伝子：TF2B
| Rat | Cq値 | Rat | Cq値 | |||||
| Adiponectin | TF2B | Adiponectin | TF2B | |||||
| ラットA Control |
A1 | 26.01 | 33.87 | ラットB 糖尿病モデル |
B1 | 30.72 | 34.23 | |
| A2 | 23.63 | 30.80 | B2 | 29.60 | 33.60 | |||
| A3 | 24.76 | 29.95 | B3 | 27.39 | 32.82 | |||
| A4 | 29.38 | 36.80 | B4 | 27.64 | 33.04 | |||
| A5 | 27.62 | 34.04 | B5 | 34.10 | 39.83 | |||
| A6 | 26.16 | 31.90 | B6 | 25.53 | 31.70 | |||
| A7 | 23.70 | 30.69 | B7 | 31.62 | 37.57 | |||
| A8 | 23.41 | 30.76 | ||||||
ダウンストリームアプリケーションに合わせて、適切なプライマーを選択してください。
⇒ 本資料使用の製品であるMaster Mixタイプは、ランダムプライマーが含まれています。
⇒ ScriptaseⅡは、プライマーを選択できる、酵素のみ（NE-LS53）, cDNA合成キット（NE-LS63）もございます。
【各プライマーの特長】
● ランダムプライマー：
ランダムな塩基配列を持った短鎖のプライマー。
例えばランダムヘキサマーの場合、理論上4,096 種類のプライマーが含まれる。反応液に含まれるRNAを様々な位置から網羅的に逆転写できるため、遺伝子の発現定量を目的とする場合に効果的である。この場合、 ポリAテールを持たない原核生物由来のmRNAや、二次構造を持つRNAでも効果的に逆転写することが可能となる。 一方、真核生物由来のmRNAにおいて、ポリAテール側から完全長cDNAをクローニングするような場合には適さない。
● oligo dT プライマー：
ポリA配列にアニーリングするプライマー。（例：真核生物由来のmRNAのポリAテールなど）
このため、主に真核生物由来のmRNAの完全長のcDNA合成に用いる。
また、真核生物の遺伝子の発現定量を目的とする場合に、ランダムプライマーに混合して使用すると、逆転写効率の向上が期待できる。
● 特異的プライマー：
ターゲットのRNA配列に基づいて、設計されたプライマー。
特定の遺伝子のみを検出する場合や、高い特異性が必要な場合に用いる。
- こちらのアプリケーションノートのPDFダウンロード ： こちら
- 製品情報詳細ページ： FastGene™ Scriptase Ⅱ
- アプリケーションノート検索ページ（型番・キーワード・アプリケーションから検索可能）
今回は60 minインキュベートさせましたが、短時間でも十分反応することが示されているので、今後使用する時には、より作業時間を短縮することができると期待しています。