日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？
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メーカー名：KAPA BIOSYSTEMS 社
下記のデータは 奈良先端科学技術大学院大学 バイオサイエンス研究科 細胞間情報学研究室
（高山研究室）久保健一様のご厚意により掲載させていただきました。
方法
ゲノムDNAテンプレートの調製
ゲノムDNAテンプレートの調製
① ペチュニア種子を、1/2濃度のMS塩を含む固形培地に無菌播種
② 播種後1週間でほぼ全ての芽生えの子葉が展開する。展開した子葉を1枚ずつ採集、8連PCRチューブに1枚ずつ集める。
③ DNA溶出バッファー(100mM Tris-HCl (pH8.0), 1M KCl, 10mM EDTA) 100μlを加え、ピペットの先端で子葉片を押しつぶす。
子葉組織から気泡を押し出す感覚で押しつぶし、組織をバラバラに壊さないことがコツ。
④ 95℃, 5 min インキュベートする。
⑤ 軽く遠心し、上清の一部をTEバッファーで10倍希釈する。
反応組成
⑤ の希釈DNA溶液 1.0μl
2×KAPA Plant Buffer 2.5μl
10μM Forward Primer 0.15μl
10μM Reverse Primer 0.15μl
KAPA3G Plant DNA Polymerase 0.05μl
100×KAPA Plant PCR enhancer 0.01μl
DW 1.14μl
Total 5.0μl※
※KAPA3G Plant PCR Kitのプロトコールでは、阻害物質の影響を軽減するため、反応量は50μlから検証を始めることを推奨しております。
結果に応じて反応量を減らすことが可能です。
プログラム
95℃ 5 min
95℃ 20 sec
54℃ 15 sec ×40サイクル
72℃ 30 sec
72℃ 2 min
解析
PCRプロダクト全量を用い電気泳動する。
結果
KAPA3G Plant PCRキットによるPCR結果
（対立遺伝子ABヘテロ接合体の次世代分離集団のジェノタイピングの一例）
マーカー ：φX174 HaeIII
lane 1-24 ：芽生え子葉由来PCR産物
電気泳動条件 ：1x TAEバッファー, 1.5 %アガロースゲル. 100V. 15 min. 反応液全量（5μl）をアプライ
対立遺伝子A（210bp）および対立遺伝子B（359bp）において、1 ～ 24の全てのサンプルでどちらか一方のバンドのみ増幅がみられた。
結果として、KAPA3G Plant PCRキットでは、各個体で安定して特異的に増幅が見られ、対立遺伝子を持つ個体と持たない個体の区別がはっきりでき、遺伝子型が容易に特定できた。
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複数遺伝子の遺伝的連鎖を観察するため、多検体に対して複数のプライマーセットで増幅を行い、安定な結果を得る必要があり、そのためのテンプレート調製方法や反応ボリュームの最適化を行った。本法で作製したテンプレートを用い、1 ヶ月以上安定な増幅が可能であったので、多数の遺伝子の連鎖を解析することができた。
これまで他社キットでは安定に増幅しなかったが、KAPA3G Plant PCR キットでは、プライマーペアの間で増幅にばらつきが小さく、安定していて使いやすい。