日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？
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製品名：
FastGene™ miRNA Enhancer（Cat.No.FG-RNAE-25）
FastGene™ RNA Premium Kit（Cat.No.FG-81006、FG-81050、FG-81250）
メーカー名：FastGene™
下記のデータは、社会医療法人大雄会医科学研究所 成瀬 有純 様のご厚意により掲載させて頂きました。
実験概要
FastGene™ miRNA Enhancerは、市販のカラム法を用いたRNA抽出キットと組み合わせることによって、microRNA（miRNA）の効果的な回収を可能にする試薬である。しかしながら、FastGene™ miRNA Enhancerを使用した際のDNase I 処理について検討を行っていなかった。
そこで、本アプリケーションノートでは、FastGene™ RNA Premium Kit、FastGene™ miRNA Enhancer使用時におけるDNase I 処理について検討を行った。
〈実験の流れ〉
- FastGene™ RNA Premium Kit を用いてmiRNA含むtotal RNA抽出/miRNA分離抽出後、DNase I 処理
- Qubit™ 4 Fluorometerを用いたdsDNA測定
- cDNA合成
- LightCycler® 96 Systemを用いたmiR-21、ACTBおよびGAPDH遺伝子解析
実験方法
- サンプル
K562 cell（1×105 cells） - 装置
LightCycler® 96 System（Roche / Cat.No.05815916001）
Qubit™ 4 Fluorometer（invitrogen / Cat.No.Q33238） - 試薬
〈RNA抽出〉
FastGene™ RNA Premium Kit（Cat.No. FG-81006、FG-81050、FG-81250）
FastGene™ miRNA Enhancer（Cat.No. FG-RNAE-25）
〈cDNA 合成〉
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche / Cat.No.04379012001）
〈dsDNA測定〉
Qubit™ dsDNA HS Assay Kit（invitrogen / Cat.No.Q32851）
〈リアルタイムPCR〉
FastStart Essential DNA Probes Master（Roche / Cat.No.06402682001）
RNA抽出/DNase I 処理方法
【miRNAを含むTotal RNA抽出（DNase I 処理なし）】
FastGene™ RNA Premium kit ＋ FastGene™ miRNA Enhancer
【miRNAを含むTotal RNA抽出（DNase I 処理あり）】
FastGene™ RNA Premium kit ＋ FastGene™ miRNA Enhancer
【miRNAを分離抽出（DNase I 処理なし）】
FastGene™ RNA Premium kit ＋ FastGene™ miRNA Enhancer
【miRNAを分離抽出（DNase I 処理あり）】
FastGene™ RNA Premium kit ＋ FastGene™ miRNA Enhancer
cDNA合成反応
【Stem-Loop RT Primerを用いたcDNA合成（miR-21）】
- Stem-Loop RT Primer sequences
miRNA Stem-Loop RT primer sequences（5’→3’） miR-21 GTCAGAGGAGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCTCCTCTGACTCAACA - 反応組成
Transcriptor RT Reaction Buffer（5×） 2 μL 10 μM Stem-loop RT Primer 0.2 μL Transcriptor Reverse Transcriptase（20 U/μL） 0.25 μL Protector RNase Inhibitor（40 U/μL） 0.25 μL Deoxynucleotide Mix（10 mM） 1 μL RNA solution 2.5 μL water 3.8 μL Total 10 μL 反応産物をTE bufferで5倍希釈して、以降の反応に使用した。
- 反応条件
Temperature Time Cycle 16℃ 30 min – 30℃ 30 sec 60 Cycles 42℃ 30 sec 50℃ 1 sec 85℃ 5 min –
【Random Hexamer PrimerおよびOligo dT Primerを用いたcDNA合成（ACTB, GAPDH）】
- 反応組成
Transcriptor RT Reaction Buffer（5×） 2 μL Random Hexamer Primer 1 μL Oligo dT Primer 0.5 μL Transcriptor Reverse Transcriptase（20 U/μL） 0.25 μL Protector RNase Inhibitor（40 U/μL） 0.25 μL Deoxynucleotide Mix（10 mM） 1 μL RNA solution 2.5 μL water 2.5 μL Total 10 μL 反応産物をTE bufferで5倍希釈して、以降の反応に使用した。
- 反応条件
Temperature Time Cycle 16℃ 30 min – 30℃ 30 sec 60 Cycles 42℃ 30 sec 50℃ 1 sec 85℃ 5 min –
リアルタイムPCR
- Primer/Probe
miR-21 Primer sequences（5’→3’） Forward GATCGGTAGCTTATCAGACTGATG Reverse GTGCAGGGTCCGGGTAAT Probe Universal ProbeLibrary Probe（Roche） #82 ACTB Primer sequences（5’→3’） Forward TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA Reverse CGTGGATGCCACAGGACT Probe Universal ProbeLibrary Probe（Roche） #27 GAPDH Primer sequences（5’→3’） Forward AGCCACATCGCTCAGACA Reverse GCCCAATACGACCAAATCC Probe Universal ProbeLibrary Probe（Roche） #60 - 反応組成
Essential Probe Master 5 μL 10 μM each primer 0.2 μL UPL probe 0.2 μL cDNA solution 2.5 μL water 1.9 μL Total 10 μL - 反応プログラム
Temperature Time Cycle 95℃ 10 min – 95℃ 10 sec 40 Cycles 60℃ 30 sec
結果
- LightCycler® 96 Systemを用いたmiR-21, ACTBおよびGAPDH遺伝子の解析（Cq値、3重測定の平均値）
miRNAを含むTotal RNA抽出miR-21 ACTB GAPDH DNase I処理（-） 21.50 18.80 19.66 DNase I処理（+） 22.10 19.60 19.83 DNase I処理（-）-DNase I処理（+） -0.60 -0.80 -0.17 miRNAを分離抽出
miR-21 ACTB GAPDH DNase I処理（-） 22.72 19.95 18.84 DNase I処理（+） 23.33 20.55 19.63 DNase I処理（-）-DNase I処理（+） -0.61 -0.60 -0.79 - Qubit ds DNA HS Assay を用いた残存dsDNAの測定
miRNAを含むTotal RNA抽出DNase I処理（-） DNase I処理（+） 1 132.5 57.0 2 176.5 50.5 3 182.5 65.5 Mean 163.8 57.7 SD 27.3 7.5 単位：ng miRNAを分離抽出
DNase I処理（-） DNase I処理（+） 1 77.5 31.2 2 53.0 39.0 3 43.8 51.0 Mean 58.1 40.4 SD 17.4 10.0 単位：ng
miRNAを含むTotal RNA抽出およびmiRNAの分離におけるCq値は、ACTBおよびGAPDH遺伝子とmiRNAはDNase I 処理においてほぼ同様の動向を示している。
また、DNase I 処理後の溶出液のdsDNA収量は低下傾向を示している。
これらより、溶出後のDNase I 処理は有効であると考えられる。
この記事で紹介した製品
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- 製品情報詳細ページ：
FastGene™ miRNA Enhancer（Cat.No.FG-RNAE-25）
FastGene™ RNA Premium Kit（Cat.No.FG-81006、FG-81050、FG-81250）
LightCycler® 96 System（Roche / Cat.No.05815916001）
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche / Cat.No.04379012001）
FastStart Essential DNA Probes Master（Roche / Cat.No.06402682001） - アプリケーションノート検索ページ（型番・キーワード・アプリケーションから検索可能）
