日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？
- 当社製品を実際にご使用頂いた、正真正銘、日本国内の研究者様による評価データ
- 製品をご検討中の方はもちろん、すでにお使いのお客様におかれましても、類似の研究をされている他の研究者の方の事例集としてご活用頂けます
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メーカー名：日本ジェネティクス株式会社
下記のデータは、近畿大学 理工学部 生命科学科 免疫分子機能研究室 早坂 晴子様のご厚意により掲載させて頂きました。
概要
当研究室では、マウスリンパ節由来RNAからの逆転写反応により、全長cDNAのクローニングを行ってきました。
既存のキット（T 社）では、比較的短いサイズのcDNAが優先的に合成されるため、目的遺伝子（390bp）のシグナルを検出できませんでした。
FastGene™ ScriptaseⅡでは、目的遺伝子のシグナルを検出でき、結果が改善できました。
実験方法
サンプル：マウス1匹よりリンパ節（鼠径、腸間膜）を摘出
Qiagen ：RNeasy Mini Kit で total RNAを精製
マウスからリンパ節（鼠経、腸間膜）を摘出する。 サンプル量：23 mg
⇓
RNAのインプット量：1μg
sample RNA 8 μL
oligo dT primer 1 μL
randam hexamer 1 μL
dNTP 2 μL
H2O 0.5 μL
⇓ 65℃ 5min
コンポーネントの追加
5x FastGene™ ScriptaseⅡ buffer 4 μL
0.1 M DTT 2 μL
RNase Inhibitor 0.5 μL
⇓ 42℃ 2min
氷上でRNA 懸濁液に、FastGene™ ScriptaseⅡを 1μL 添加する
⇓ 42℃ 50min
⇓ 72℃ 15 分間 インキュベート
4℃で保管
・少量のRNAから、cDNAを合成できる・低活性RNaseH のため、より長いcDNAを得ることができる
これ以外にも、RT-qPCRやNGSなど様々なアプリケーションでご使用になれます。
qPCRでの使用に便利な MasterMix（5X）タイプ（CatNo.NE-LS64）もございます。
⇓
KAPA2G Robust にて PCR
Initial denaturation 98℃ 2min
Denaturation 95℃ 15sec
Annealing 57℃ 30sec ×35 cycles
Extension 68℃ 2min
KAPA2G Robust（CatNo.KK5004）
・テンプレートの精製具合に影響を受けにくくPCR阻害物質に耐性を持っている
・独自の酵素安定化剤により、凍結融解の影響が非常に少ない
電気泳動に便利なwith dye のタイプもあります。（CatNo.KK5706）
⇓
電気泳動
電気泳動装置 ：Mupid-exU（ADV EXU-1 )
核酸染色試薬 ：RedSafe（ INB-21141 ）
泳動buffer ：TBE buffer
アガロースゲルの濃度 ： 2 ％
電圧と泳動時間 ： 100 V / 30 min
結果
← 390bp
目的遺伝子の明瞭なシグナルが確認できた
← 390bp
他社のRT 酵素 + oligo dT primerを用いた場合はシグナルが弱かった
※同時比較は行っていません
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また、全長cDNAも電気移動でバンドを確認することが出来ました。
キットとしては良い製品だと思います。