【お客様事例】FastGene™ miRNA Enhancerを用いた植物からのmiRNA抽出効率の改善

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下記のデータは、社会医療法人大雄会医科学研究所 成瀬 有純 様のご厚意により掲載させて頂きました。

概要

FastGene™ miRNA Enhancerは、市販のカラム法を用いたRNA抽出キットと組み合わせることによって、microRNA（miRNA）の効果的な回収を可能にする試薬である。これまで、培養細胞・FFPE・全血・筋肉組織での実績はあったが、植物での実績はなかった。
そこで、本アプリケーションノートでは、植物からのmiRNA抽出におけるFastGene™ miRNA Enhancer の抽出効率の改善効果について検討を行った。

実験の流れ

1. TRIsure、FastGene™ RNA Basic Kit、FastGene™ miRNA Enhancerを用い、RNA抽出
2. stem-loop RT primer、Random Hexamer primerおよびoligo dT primerを用い、cDNA合成
3. リアルタイムPCRにて測定
4. ΔCq= Target gene Cq- Housekeeping gene Cqとし、2^-ΔCqにてmiRNA量を比較

実験条件

• サンプル
  トウモロコシの実
  枝豆の豆
  キャベツの葉
• 使用試薬
  〈RNA抽出使用試薬〉
  FastGene™ miRNA Enhancer（FastGene / Cat.No. FG-RNAE-S, FG-RNAE-25）
  FastGene™ RNA Basic Kit（FastGene / Cat.No. FG-80006, FG-80050, FG-80250）
  TRIsure（meridian Bioscience / Cat.No. BIO-38032）
  〈cDNA合成使用試薬〉
  Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche / Cat.No. 04379012001)
  〈リアルタイムPCR〉
  FastStart Essential DNA Green Master（Roche / Cat.No. 06402712001)
• 使用装置
  LightCycler^® 96 システム（Roche / Cat.No. 05815916001）

RNA抽出方法

結果

リアルタイムPCR

トウモロコシ

FastGene™ miRNA Enhancerの添加により137.3倍のmiRNAが抽出された。

枝豆

FastGene™ miRNA Enhancerの添加により632.2倍のmiRNAが抽出された。

キャベツ

FastGene™ miRNA Enhancerの添加により50.1倍のmiRNAが抽出された。

FastGene miRNAエンハンサーを用いた細胞株や種々の臨床検体でその有用性が示されていますが、今回はそれ以外の試料を検討しました。
いずれも臨床検体と同様の効果が認められ、幅広い対象にて有効であることが明らかとなりました。

補足

cDNA合成反応

Stem-loop RT Primerを用いたcDNA合成（miR159, miR319で実施）

• Stem-loop RT Primer sequences
  

  miRNA	Stem-loop RT primer sequence（5′ – 3’）
  miR159*	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAAGAGCT
  miR319*	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAGGGAGC

  *Plant, Cell and Environment（2012）35, 502–512

• 反応組成
  

  Transcriptor RT Reaction Buffer（5×）	2 μL
  10 μM Stem-loop RT Primer	0.2 μL
  Transcriptor Reverse Transcriptase（20 U/μL）	0.25 μL
  Protector RNase Inhibitor（40 U/μL）	0.25 μL
  Deoxynucleotide Mix（10 mM）	1 μL
  RNA solution	2.5 µL
  water	3.8 μL
  Total	10 μL

  反応産物をTE bufferで5倍希釈して、以降の反応に使用した。

• 反応条件
  

  Temperature	Time	Cycle
  16℃	30 min	–
  30℃	30 sec	60 Cycles
  42℃	30 sec
  50℃	1 sec
  85 ℃	5 min	–

Random Hexamer PrimerおよびOligo dT Primerを用いたcDNA合成（EF1A, ACT11, GAPDHで実施）

• 反応組成
  

  Transcriptor RT Reaction Buffer（5×）（Roche）	2 µL
  Random Hexamer Primer	1 μL
  Oligo dT Primer	0.5 μL
  Transcriptor Reverse Transcriptase（20 U/μL）（Roche）	0.25 μL
  Protector RNase Inhibitor（40 U/μL）（Roche）	0.25 μL
  Deoxynucleotide Mix（10 mM）（Roche）	1 μL
  RNA solution	2.5 µL
  water	2.5 μL
  Total	10 μL

  反応産物をTE bufferで5倍希釈して、以降の反応に使用した。

• 反応条件
  

  Temperature	Time
  25℃	10 min
  55℃	60 min
  85℃	5 min

リアルタイムPCR

• PCR primer sequences
  

  miRNA	Forward primer sequence（5′ – 3’）	Reverse primer sequence（5′ – 3’）
  miR159	GCGGCGTTGGATTGAAGGG	GTGCAGGGTCCGAGGT
  miR319	GCGGCGTTGGACTGAAGGGT

  *Plant, Cell and Environment（2012）35, 502–512

• Housekeeping genes
  

  	Gene	Forward primer sequence（5′ – 3’）	Reverse primer sequence（5′ – 3’）
  トウモロコシ*1	EF1A	TGGGCCTACTGGTCTTACTACTGA	ACATACCCACGCTTCAGATCCT
  枝豆*2	ACT11	ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC	GCTGGTCCTGGCTGTCTCC
  キャベツ*3	GAPDH	AGAGCCGCTTCCTTCAACATCATT	TGGGCACACGGAAGGACATACC

  *1 PLoS One. 2014; 9（5）: e95445.
  *2 PLoS One. 2017; 12（12）: e0189405.
  *3 PLoS One. 2018 Sep 7;13（9）:e0203656

• 反応組成
  

  FastStart Essential DNA Green Master	5 µL
  10 μM Forward primer	0.2 μL
  10 μM Reverse primer	0.2 μL
  cDNA	2.5 μL
  water	2.1 μL
  Total	10 μL

• 反応プログラム
  

  Temperature	Time	Cycle
  95℃	10 min	–
  95℃	10 sec	40 Cycles
  60℃	10 sec
  72℃	10 sec

この記事で紹介した製品

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