【お客様事例】アンチセンス法によるノックダウン後の安定したRNA抽出とqPCR定量

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アプリケーションノート　2018＜14＞　
製品名：TRIsure（トータルRNA抽出試薬）（BIO-38032）
メーカー名：BIOLINE 社

下記のデータは、東京大学定量生命科学研究所分子情報研究分野（秋山研究室）山角祐介様のご厚意により掲載させていただきました。

概要

geneXに対するantisense oligoを用いたノックダウン実験を実施した。目的遺伝子をノックダウンさせた細胞からTRIsureにてRNAを抽出した。
逆転写反応によりcDNAに変換後、リアルタイムPCRによる定量を行った。
核酸の種類は2 種類（NA-1, NA-2）、antisense oligoの配列は2配列（Anti-GeneX-1,Anti-GeneX-2）を用いた。

TRIsure（トータルRNA抽出試薬）
　 Cat.No. BIO-38032

　• フェノール抽出試薬
　 • 有機相が淡緑色に色が付くため水相（RNAを含む）の回収が容易
　 • RNAの抽出が約１時間で可能
　 • 操作しやすい広口ボトル

ワークフロー

1．サンプル準備
1）A549 細胞1.1×105 cell/ml×1 ml /well をプレートに播種した。
　（プレート：TrueLine Cell Culture Plates 12ウェルタイプ（TrueLine））
2）細胞にReverse transfectionでAntisense oligoを導入した。
　（トランスフェクション試薬：ipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent（Thermo Fisher Scientific ））
3）48時間培養後、培地を捨て、PBSで細胞を洗浄した。

3．RNAの収量・濃度測定　　┗RNAの濃度をNanoDropで測定した。　　——結果1．収量・純度の測定結果 4．逆転写反応　　┗RNAを逆転写反応させ、cDNAを合成した。　　　（逆転写酵素：PrimeScript™ RT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa））
	●反応組成		●反応プログラム
	Total RNA	500 ng	アニーリング・逆転写反応	37℃ ・15 min
	Primescript RT Master Mix	2 μL	↓
	MilliQ	up to 10 μL	逆転写酵素の熱失活	85℃ ・5 sec
	（total volume 　 10 μL）		↓
			ホールド	4℃

結果

結果1. 収量・純度の測定結果

		ng/μL	A260/A280	A260/A230	A260	A280	A230
NA-1	Control	188.78	1.86	1.68	4.72	2.53	2.82
	Anti-geneX-1	202.10	1.77	2.22	5.05	2.86	2.28
	Anti-geneX-2	188.93	1.85	2.07	4.72	2.56	2.28
NA-2	Control	207.63	1.95	0.54	5.19	2.66	9.67
	Anti-geneX-1	171.65	1.78	2.06	4.29	2.41	2.08
	Anti-geneX-2	192.49	1.79	2.13	4.81	2.68	2.26