【お客様事例】プラスミドの制限酵素による切断とDNA断片の確認

日本ジェネティクスのアプリケーションノートとは？

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アプリケーションノート 2018<10>

製品名：ミドリグリーンアドバンス（Cat No. NE-MG04）
メーカー名：日本ジェネティクス株式会社

製品名：FAS-Digi（Cat No. FAS-DGMU, FAS-DGDC-LX, LB-16BG）
メーカー名：日本ジェネティクス株式会社

下記のデータは、東京医科大学生化学分野高野直治様、森谷昇太様のご厚意により掲載させて頂きました。

本実験の目的

学生実習において、プラスミドの制限酵素マップの描き方と制限酵素の働きについて学ぶため、本実験を行った。
プラスミドを制限酵素処理により切断し、電気泳動にて切断後のDNA断片の長さを確認した。

核酸染色試薬 ミドリグリーンアドバンス
(Cat No.NE-MG04)

ゲル撮影装置 FAS-Digi
FAS-Digi ダークボックス本体のみ(Cat No. FAS-DGMU)
FAS-Digi専用デジタルカメラ(Cat No. FAS-DGDC-LX)
Blue/Green LEDイルミネーター（500nm)
(Cat No. LB-16BG)

実験方法

1.5mL チューブにて下記通りの溶液を調製する。

プラスミド（サンプル）（100ng/μL） 5 μL
TOYOBO 10×H buffer 5 μL
超純水（H2O） 40 μL
total 50 μL×4本

上記で調製したチューブに、制限酵素を2.5 μLずつ加える。（下図参照）
プラスミドに４通りの制限酵素処理を行う。

(SalI, BamHI：TOYOBO社)
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タッピングを行いよく混ぜる。
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卓上遠心機で遠心： 5sec

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37℃ウォーターバスにてインキュベーション： 1h
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10x ローディングバッファー 5 μL を加える（ニッポンジーン：313-90111）
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タッピングを行いよく混ぜる
　　↓
下図のように、先染めゲルにサンプルをアプライする。

　(1%アガロースゲル)
　　↓
電気泳動：100 V
バッファー：TBE
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ローディングバッファーに含まれる青い色素が、ゲル全体の1/2まで進んだら泳動を終了する。
（LEDトランスイルミネーターでDNAのバンドを観察する。）
　　↓
ゲル撮影を行い、結果を確認する。

実験結果

FAS-Digi にて撮影

プラスミドの制限酵素マップの描き方、制限酵素の働きについて学ぶ学生実習に使用しました。
エチブロでは、ゲルの先染めを行うとエチブロの汚染エリアが拡大してしまうといった問題がありましたがミドリグリーンではそのような問題がなく、泳動後、すぐに結果を確認できるため助かっています。
安全かつ、従来のエチブロ後染めにかかっていた分の時間を節約できました。
悪かった点は、ゲルの先染めを行うと、低分子側の染色が弱くなることですが泳動を行いながらLEDで観察することができるので、ちょうどよいところで泳動をストップでき、特に問題にはなっていません。